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1概念

2詳解

3研究內(nèi)容

4基本途徑

1概念

以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過化學、物理和分子生物學的手段進行基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類對生產(chǎn)和生活的需求。

2詳解

蛋白質(zhì)是一切生命活動存在的物質(zhì)基礎(chǔ)和形式，同時也是診斷疾病、治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)或藥物。人類蛋白數(shù)量不僅遠超過基因數(shù)量，而且由于蛋白質(zhì)的可變性和多樣性導致了蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠比核酸技術(shù)要復雜和困難的多。因此人類蛋白質(zhì)構(gòu)成了后基因組時代重要的研究內(nèi)容，具有無限廣闊的研究前景。

蛋白質(zhì)是生命的體現(xiàn)者，離開了蛋白質(zhì)，生命將不復存在。可是，生物體內(nèi)存在的天然蛋白質(zhì)，有的往往不盡人意，需要進行改造。由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質(zhì)有自己*的氨基酸順序，所以改變其中關(guān)鍵的氨基酸就能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。而氨基酸是由三聯(lián)體密碼決定的，只要改變構(gòu)成遺傳密碼的一個或兩個堿基就能達到改造蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)工程的一個重要途徑就是根據(jù)人們的需要，對負責編碼某種蛋白質(zhì)的基因重新進行設(shè)計，使合成的蛋白質(zhì)變得更符合人類的需要。這種通過造成一個或幾個堿基定點突變，以達到修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)目的的技術(shù)，稱為基因定點突變技術(shù)。

蛋白質(zhì)工程是在基因重組技術(shù)、生物化學、分子生物學、分子遺傳學等學科的基礎(chǔ)之上，融合了蛋白質(zhì)晶體學、蛋白質(zhì)動力學、蛋白質(zhì)化學和計算機輔助設(shè)計等多學科而發(fā)展起來的新興研究領(lǐng)域。其內(nèi)容主要有兩個方面：根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；確定蛋白質(zhì)化學組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)之上，實現(xiàn)從氨基酸序列預測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計合成具有特定生物功能的全新的蛋白質(zhì)，這也是蛋白質(zhì)工程根本的目標之一。

蛋白質(zhì)工程尚未有統(tǒng)一的定義。一般認為蛋白質(zhì)工程就是通過基因重組技術(shù)改變或設(shè)計合成具有特定生物功能的蛋白質(zhì)。實際上蛋白質(zhì)工程包括蛋白質(zhì)的分離純化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的分析、設(shè)計和預測，通過基因重組或其它手段改造或創(chuàng)造蛋白質(zhì)。從廣義上來說，蛋白質(zhì)工程是通過物理、化學、生物和基因重組等技術(shù)改造蛋白質(zhì)或設(shè)計合成具有特定功能的新蛋白質(zhì)。利用基因工程的手段，在目標蛋白的氨基酸序列上引入突變，從而改變目標蛋白的空間結(jié)構(gòu)，終達到改善其功能的目的。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)工程手段大多通過引入隨機突變來改造目標蛋白，隨著計算機技術(shù)和生物信息學技術(shù)的飛速發(fā)展，計算機模擬被越來越多的應用到蛋白質(zhì)工程中，從而衍生出半合理化設(shè)計，合理化設(shè)計等多種新的蛋白質(zhì)工程的手段。例如國內(nèi)的尚科生物醫(yī)藥上海有限公司通過對蛋白質(zhì)DNA改組，定向進化對酶進行合理化設(shè)計，從而提高酶的活性。[2]

3研究內(nèi)容

1. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

——基礎(chǔ)

2. 結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計和預測

——基礎(chǔ)的應用與驗證

3. 創(chuàng)造和/或改造蛋白質(zhì)——新蛋白質(zhì)

——終目標

4基本途徑

從預期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計預期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應有的氨基酸序列→找到相對應的核糖核苷酸序列（RNA）→找到相對應的脫氧核糖核苷酸序列（DNA）[3] 。

蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。也就是說，蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程，是包含多學科的綜合科技工程領(lǐng)域。

結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息，以便建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。三維空間結(jié)構(gòu)的測定是驗證蛋白質(zhì)設(shè)計的假設(shè)即證明是新結(jié)構(gòu)改變了原有生物功能的必需手段。晶體學的技術(shù)在確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面有了很大發(fā)展，但是明顯的不足是需要分離出足夠量的純蛋白質(zhì)（幾毫克～幾十毫克），制備出單晶體，然后再進行繁雜的數(shù)據(jù)收集、計算和分析。

另外，蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同，在分析的時候要考慮到這個問題。核磁共振技術(shù)可以分析液態(tài)下的肽鏈結(jié)構(gòu)，這種方法繞過了結(jié)晶、X－射線衍射成像分析等難點，直接分析自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。現(xiàn)代核磁共振技術(shù)已經(jīng)從一維發(fā)展到三維，在計算機的輔助下，可以有效地分析并直接模擬出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)與輔基和底物結(jié)合的情況以及酶催化的動態(tài)機理。從某種意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質(zhì)的突變。國外有許多研究機構(gòu)正在致力于研究蛋白質(zhì)與核酸、酶抑制劑與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，以開發(fā)具有高度專一性的藥用蛋白質(zhì)。

結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計和預測

根據(jù)對天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)，可以預測一定氨基酸序列肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物功能；反之也可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。通過基因重組等實驗可以直接考察分析結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系；也可以通過分子動力學、分子熱力學等，根據(jù)能量低、同一位置不能同時存在兩個原子等基本原則分析計算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能。雖然這方面的工作尚在起步階段，但可預見將來能建立一套完整的理論來解釋結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，用以設(shè)計、預測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。

創(chuàng)造改造

蛋白質(zhì)的改造，從簡單的物理、化學法到復雜的基因重組等等有多種方法。物理、化學法：對蛋白質(zhì)進行變性、復性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)像等等；生物化學法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學基團，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等。以上方法只能對相同或相似的基團或化學鍵發(fā)生作用，缺乏特異性，不能針對特定的部位起作用。采用基因重組技術(shù)或人工合成DNA，不但可以改造蛋白質(zhì)而且可以實現(xiàn)從頭合成全新的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)是由不同氨基酸按一定順序通過肽鍵連接而成的肽構(gòu)成的。氨基酸序列就是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，它決定著蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白質(zhì)的基因的DNA序列決定的，改變DNA序列就可以改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的可調(diào)控生物合成。在確定基因序列或氨基酸序列與蛋白質(zhì)功能之間關(guān)系之前，宜采用隨機誘變，造成堿基對的缺失、插入或替代，這樣就可以將研究目標限定在一定的區(qū)域內(nèi)，從而大大減少基因分析的長度。一旦目標DNA明確以后，就可以運用定位突變等技術(shù)來進行研究。

定位突變蛋白質(zhì)中的氨基酸是由基因中的三聯(lián)密碼決定的，只要改變其中的一個或兩個就可以改變氨基酸。通常是改變某個位置的氨基酸，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或催化特性。噬菌體M13的生活周期有二個階段，在噬菌體粒子中其基因組為單鏈，侵入宿主細胞以后，通過復制以雙鏈形式存在。將待研究的基因插入載體M13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個或幾個非配對堿基）作為引物，合成相應的互補鏈，用T4連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內(nèi)分別復制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯配堿基的就為突變型。再轉(zhuǎn)入合適的表達系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。

盒式突變1985年Wells提出的一種基因修飾技術(shù)——盒式突變，一次可以在一個位點上產(chǎn)生20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質(zhì)分子中重要氨基酸進行“飽和性”分析。利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側(cè)造成兩個原載體和基因上沒有的內(nèi)切酶切點，用該內(nèi)切酶消化基因，再用合成的發(fā)生不同變化的雙鏈DNA片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。

PCR技術(shù)DNA聚合酶鏈式反應是應用廣泛的基因擴增技術(shù)。以研究基因為模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一個或幾個非互補的堿基）為引物，直接進行基因擴增反應，就會產(chǎn)生突變型基因。分離出突變型基因后，在合適的表達系統(tǒng)中合成突變型蛋白質(zhì)。這種方法直接、快速和。

高突變率技術(shù)從大量的野生型背景中篩選出突變型是一項耗時、費力的工作。有兩種新的突變方法具有較高的突變率：①硫代負鏈法：核苷酸間磷酸基的氧被硫替代后修飾物（α－（S）－dCTP）對某些內(nèi)切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成負鏈，然后用內(nèi)切酶處理，結(jié)果僅在正鏈上產(chǎn)生“缺口”，用核苷酸外切酶III從3`→5`擴大缺口并超過負鏈上錯配的核苷酸，在聚合酶作用下修復正鏈，就可以得到二條鏈均為突變型的基因；②UMP正鏈法：大腸桿菌突變株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在這種宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）摻入模板而不被修飾。用這種含U的模板產(chǎn)生的突變雙鏈轉(zhuǎn)化正常大腸桿菌，結(jié)果含U的正鏈被寄主降解，而突變型負鏈保留并復制。

蛋白質(zhì)融合將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上或?qū)⒉煌鞍踪|(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達，產(chǎn)生出新的融合蛋白質(zhì)。這種方法可以將不同蛋白質(zhì)的特性集中在一種蛋白質(zhì)上，顯著地改變蛋白質(zhì)的特性。現(xiàn)在研究的較多的所謂“嵌合抗體”和“人緣化抗體”等，就是采用的這種方法。

5實際應用

提高穩(wěn)定性

提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性包括以下幾個方面：（1）延長酶的半壽期；（2）提高酶的熱穩(wěn)定性；（3）延長藥用蛋白的保存期；（4）抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失[3] 。

葡萄糖異構(gòu)酶（GI）在工業(yè)上應用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，朱國萍等人在確定第138位甘氨酸（Gly138）為目標氨基酸后，用雙引物法對GI基因進行體外定點誘變，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達，結(jié)果突變型GI比野生型的熱半衰期長一倍；適反應溫度提高10～12℃；酶比活相同。據(jù)分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了一個吡咯環(huán)，該側(cè)鏈剛好能夠填充于Gly138附近的空洞，使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更具剛性，從而提高了酶的熱穩(wěn)定性。

融合蛋白質(zhì)

腦啡肽（Enk）N端5肽線形結(jié)構(gòu)是與δ型受體結(jié)合的基本功能區(qū)域，干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細胞因子。黎孟楓等人化學合成了EnkN端5肽編碼區(qū)，通過一連接3肽編碼區(qū)與人α1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達了這一融合蛋白。以體外人結(jié)腸腺癌細胞和多形膠質(zhì)瘤細胞為模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細胞生長的活性顯著高于單純的IFN，通過Naloxone競爭阻斷實驗證明，抑制活性的增高確由Enk導向區(qū)介導。

活性改變

通常飯后30～60min，人血液中胰島素的含量達到高峰，120～180min內(nèi)恢復到基礎(chǔ)水平。而目前臨床上使用的胰島素制劑注射后120min后才出現(xiàn)高峰且持續(xù)180～240min，與人生理狀況不符。實驗表明，胰島素在高濃度（大于10－5mol/L）時以二聚體形式存在，低濃度時（小于10－9mol/L）時主要以單體形式存在。設(shè)計*胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。類胰島素生長因子－I（IGF－I）的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與胰島素具有高度的同源性和三維結(jié)構(gòu)的相似性，但IGF－I不形成二聚體。IGF－I的B結(jié)構(gòu)域（與胰島素B鏈相對應）中B28－B29氨基酸序列與胰島素B鏈的B28－B29相比，發(fā)生顛倒。因此，將胰島素B鏈改為B28Lys－B29Pro，獲得單體*胰島素。該*胰島素已通過臨床實驗。

治癌酶改造

癌癥的基因治療分二個方面：藥物作用于癌細胞，特異性地抑制或殺死癌細胞；藥物保護正常細胞免受化學藥物的侵害，可以提高化學治療的劑量。皰癥病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其他結(jié)構(gòu)類似物如GANCICLOVIR和ACYCLOVIR無環(huán)鳥苷磷酸化。GANCICLOVIR和ACYCLOVIR缺少3`端羥基，就可以終止DNA的合成，從而殺死癌細胞。HSV－TK催化GANCICLOVIR和ACYCLOVIR的能力可以通過基因突變來提高。從大量的隨機突變中篩選出一種，在酶活性部位附近有6個氨基酸被替換，催化能力分別提高43和20倍。O6－烷基－鳥嘌呤是DNA經(jīng)烷基化劑（包括化療用亞硝基藥物）處理以后形成的主要誘變劑和細胞毒素，所以這些亞硝基藥物的使用劑量受到限制。O6－烷基－鳥嘌呤－DNA烷基轉(zhuǎn)移酶O6－Alkylguanine－DNAalkyltransferase（AGT）能夠?qū)ⅧB嘌呤O6上的烷基去除掉，起到保護作用。通過反向病毒轉(zhuǎn)染，人類AGT在鼠骨髓細胞中表達并起到保護作用。通過突變處理，得到一些正突變AGT基因且活性都比野生型的高，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)一個突變基因中的第139位脯氨酸被丙氨酸替代。

嵌合抗體

免疫球蛋白呈Y型，由二條重鏈和二條輕鏈通過二硫鍵相互連接而構(gòu)成。每條鏈可分為可變區(qū)（N端）和恒定區(qū)（C端），抗原的吸附位點在可變區(qū)，細胞毒素或其他功能因子的吸附位點在恒定區(qū)。每個可變區(qū)中有三個部分在氨基酸序列上是高度變化，在三維結(jié)構(gòu)上是處在β折疊端頭的松散結(jié)構(gòu)（CDR），是抗原的結(jié)合位點，其余部分為CDR的支持結(jié)構(gòu)。不同種屬的CDR結(jié)構(gòu)是保守的，這樣就可以通過蛋白質(zhì)工程對抗體進行改造。

鼠單克隆抗體被人免疫系統(tǒng)排斥，它潛在的治療作用得不到利用。嵌合抗體就是用人抗體的恒定區(qū)替代鼠單克隆抗體的恒定區(qū)，這樣它的免疫原性就顯著下降。如用于治療直腸結(jié)腸腺癌（COLORECTALADENOCARCINOMA）的單克隆抗體Mab17－1A。盡管嵌合抗體還存在著免疫原的問題，但仍有幾種嵌合抗體通過了臨床實驗。所謂人緣化抗體就是將抗原吸附區(qū)域嫁接到人抗體上，這樣抗體上的外源肽鏈降低到小，免疫原性也就小。但是，僅將CDR轉(zhuǎn)接到人抗體上，其抗原吸附能力很小，必須帶上幾個框架氨基酸殘基，才能保持原有的吸附力。這樣就存在免疫原性與抗原吸附力之間的矛盾。通過逐個氨基酸替代或計算機模擬分析，可在保持原有吸附力的基礎(chǔ)之上，盡可能地降低免疫原性。個臨床上應用的用于治療淋巴肉芽腫病和風濕性關(guān)節(jié)炎的人緣化抗體CAMPATH－1H，盡管療效顯著，但仍有半數(shù)以上的患者有免疫反應。而其他人緣化抗體如治療脊髓性白血病的ANTI－CD33等，其免疫反應可以忽略不計。

進展

當前，蛋白質(zhì)工程是發(fā)展較好、較快的分子工程。這是因為在進行蛋白質(zhì)分子設(shè)計后，已可應用的基因工程來進行蛋白的合成。早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982—1985年間對酪氨酰—t—RNA合成酶的分子改造工作。他根據(jù)XRD（X射線衍射）實測該酶與底物結(jié)合部位結(jié)構(gòu)，用定位突變技術(shù)改變與底物結(jié)合的氨基酸殘基，并用動力學方法測量所得變體酶的活性，深入探討了酶與底物的作用機制。佩里（Perry）1984年通過將溶菌酶中Ile（3）改成Cys（3），并進一步氧化生成 Cys（3）-Cys（97）二硫鍵，使酶熱穩(wěn)定性提高，顯著改進了這種食品工業(yè)用酶的應用價值。1987年福什特通過將枯草桿菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而導致了活性中心His（64）質(zhì)子pKa從7下降到6，使酶在pH=6時的活力提高10倍。工業(yè)用酶佳pH的改變預示可帶來巨大經(jīng)濟效益。蛋白工程還可對酶的催化活性、底物專一性、抗氧化性、熱變性、堿變性等加以改變。由此可以看出蛋白工程的威力及其光輝前景。上述各例是通過對關(guān)鍵氨基酸殘基的置換與增刪進行蛋白工程的一類方法。另一類是以某個典型的折疊進行“從頭設(shè)計”的方法。1988年杜邦公司宣布，成功設(shè)計并合成了由四段反平行α—螺旋組成為73個氨基殘基的成果。這顯示，按人們預期要求，通過從頭設(shè)計以折疊成新蛋白的目標已是可望又可及了。預測結(jié)構(gòu)的模型法，在奠定分子生物學基礎(chǔ)時起過重大作用。蛋白的一級結(jié)構(gòu)，包含著關(guān)于結(jié)構(gòu)的信息這一點已日益明確。結(jié)合模型法，通過分子工程來預測結(jié)構(gòu)，已成為人們所矚目的問題了。

蛋白質(zhì)工程匯集了當代分子生物學等學科的一些前沿領(lǐng)域的新成就，它把核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生物功能結(jié)合起來研究。蛋白質(zhì)工程將蛋白質(zhì)與酶的研究推進到嶄新的時代，為蛋白質(zhì)和酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面的應用開拓了誘人的前景。蛋白質(zhì)工程開創(chuàng)了按照人類意愿改造、創(chuàng)造符合人類需要的蛋白質(zhì)的新時期。

前景

蛋白質(zhì)工程匯集了當代分子生物學等學科的一些前沿領(lǐng)域的新成就，它把核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生物功能結(jié)合起來進行研究。蛋白質(zhì)工程將蛋白質(zhì)與酶的研究推進到嶄新的階段，為蛋白質(zhì)和酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面的應用開拓了誘人的前景。蛋白質(zhì)工程開創(chuàng)了按照人類意愿改造、創(chuàng)造符合人類需要的蛋白質(zhì)的新時代。蛋白質(zhì)工程取得的進展向人們展示出了誘人的前景。例如，科學家通過對胰島素的改造，已使其成為*型藥品。如今，生物和材料科學家正積極探索將蛋白質(zhì)工程應用于微電子方面。用蛋白質(zhì)工程方法制成的電子組件，具有體積小、耗電少和效率高的特點，因此有極為廣闊的發(fā)展前景[4] 。