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（一）蛋白質的分離
利用5％～20％梯度的SDS-PAGE、尿素—PAGE、等電點聚焦（1EF）—PAGE、雙向凝膠或瓊脂糖凝膠作為介質，對蛋白質樣品進行分離，其基本操作與凝膠電泳一樣。不同之處是，凝膠厚度需0．8mm，經分離后的凝膠（SDS-PAGE除外）要浸泡在含SDS的緩沖液中，使蛋白質帶上負電荷，以利于凝膠中的蛋白質在電場中轉移到正極邊的NC膜上。因此，在分離蛋白質時，大多數是用SDS-PAGE系統進行的。不過，也有用非SDS-PAGE系統替代的，如用此系統進行轉移操作時，則需將凝膠上的蛋白質轉移到處于正極和負的兩張NC膜上（即將凝膠置兩張NC膜之間），該程序的靈敏度較低。

（二）NC膜的處理
取一張與凝膠條大小相等的NC紙（用手術刀切），浸泡在電泳轉移的緩沖液（一般為25mmol／L Tris，191mmol／L甘氨酸，20％甲醇）中0．5h（國產NC紙浸泡2h以上）。

（三）凝膠的處理
樣品在SDS-PAGE中電泳后，切下欲轉移的凝膠條區段或將整個凝膠板浸泡在電泳轉移緩沖液中0．5h，輕輕搖動除去膠中的SDS、巰基乙醇等物質，使凝膠中的離子強度與轉移液相同，以利于蛋白質恢復其天然結構和生物學活性，防止凝膠的膨脹。

（四）準備海綿和濾紙
剪裁與NC膜大小相同的海綿和濾紙各兩塊，用電極緩沖液浸濕。

（五）“夾心餅”的制作
先把有孔洞的有機玻璃板放在干凈的玻璃板上，然后蓋上一塊海綿，海綿上鋪一層濾紙，接著小心地把凝膠平放在濾紙上，NC膜要端端正正地放在膠面上（一旦放下就勿拿起）。在NC膜上依次蓋上濾紙、海綿和有孔洞的有機玻璃板。zui后用橡皮筋捆緊，放入裝有電極緩沖液的電場中。夾有凝膠的一端朝負極，夾有NC膜的一端朝正極。通電后調節電流為60mA左右（恒流），4℃環境下電泳6—18h。在制作“夾心餅”時，每兩層之間不能有氣泡，否則影響樣品的轉移。此外，電極液中應含有20％的甲醇，以防電泳過程中凝膠變形。分子質量大轉移時間長，反之則時間短。通常轉移過程也是進一步除去SDS和恢復轉移物質的結構與生物活性的過程。

（六）鑒定
1．酶聯免疫吸附測定法（ELISA） （1）試劑：①PBS液，含0．15mol／LNaCl的0．025mol／L磷酸鹽緩沖液，pH7．4；②PBS-T液，含0．3％吐溫的PBS液（淬滅劑）；③HBP-IgG溶液，HRP-人抗體復合物溶液；④聯苯茴香胺溶液，50mg聯苯茴香胺溶于10ml甲醇中；⑤染色液（用前配制），取27ml bPBS-T液，3ml聯苯茴香胺液，35ul3％過氧化氫溶液混勻。
（2）染色：印跡后的NC膜在50～200mlPBS液中漂洗5min，除去粘在NC膜上的凝膠，而后在PBS-T或PBS-BSA（含3％的牛血清清蛋白的PBS）溶液中，37℃環境下，手搖振蕩15min（封阻反應），與酶標記物溶液20ml（1；25，稀釋度視HRP活力高低而定）反應2h（37℃環境下），再用PBS、PBS-T或PBS-BSA分別漂洗。接著轉入30ml（如膜為4cmX8cm時）染色液浸泡5min左右，即可顯出特異的抗原棕色譜帶（注意：一旦譜帶顯示立即取出），用蒸餾水漂洗后，密封保存于4℃的蒸餾水中。
2．放射自顯影術 封阻后的NC紙與放射性核素標記的抗體或其他相應的配體進行反應，接著經過漂洗、烘干、壓片和沖洗，即可呈現自顯影譜帶。
除上述鑒定方法以外，使用印度墨水、天津繪圖墨水、氨基黑和考馬斯亮藍等試劑也可進行染色，以鑒定印跡在NC膜上的蛋白質譜帶。