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原位雜交
發(fā)布時(shí)間：2010-12-18用特定標(biāo)記的已知序列核酸作為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法稱為核酸原位雜交（nucleic acid hybridizationin situ）。該技術(shù)zui早應(yīng)用于20世紀(jì)60年代末期。由于核酸分子雜交的特異性高，并可定位，因此該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究。例如用標(biāo)記的探針與分裂中期染色體DNA雜交以研究染色質(zhì)中特定核酸序列在染色體中的定位；用特異性的細(xì)菌、病毒的核酸作為探針對(duì)組織與細(xì)胞進(jìn)行雜交，以確定有無該病原體的感染等。原位雜交能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對(duì)于那些細(xì)胞數(shù)量少且散在于其他組織中的細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA研究更為方便；同時(shí)由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有*的敏感性，并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。
核酸包括組織細(xì)胞的固定、預(yù)雜交、雜交、沖洗及信號(hào)檢測(cè)等基本步驟。
（一）組織或細(xì)胞的固定
是在載玻片上進(jìn)行的，因此進(jìn)行的*步就是將組織或細(xì)胞固定在載玻片上。常用于核酸的固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、乙醇：冰醋酸（3：1）、戊二醛、Garnoy固定液、Bouin固定液等。這些固定液都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，因此要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇*的固定液。
（二）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理
固定到載玻片上的組織細(xì)胞中的核酸是與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的，這種核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體會(huì)影響探針與核酸的結(jié)合，因此，降解核酸表面的蛋白質(zhì)是雜交前預(yù)處理的關(guān)鍵。一般采用去垢劑和（或）蛋白酶對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行部分性的消化，使探針在細(xì)胞基質(zhì)中獲得zui大的穿透力。常用的去垢劑有TritonX—100和十二烷基磺酸鈉（SDS），常用的蛋白酶為蛋白酶K。所選用的蛋白酶中不能含有核酸酶；消化組織細(xì)胞的時(shí)間不能過長，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞或使核酸從載玻片上脫落。
（三）探針的選擇和標(biāo)記
中所用的探針可以是DNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針等，一般標(biāo)記的DNA或RNA探針的長度以50—300bp為好，這個(gè)長度的探針在組織細(xì)胞中的穿透力好。雙鏈DNA探針是zui常用的探針之一，但雜交時(shí)濃度高了易引起探針之間互補(bǔ)鏈的退火；用M1：克隆載體可制備單鏈cDNA探針，其zui大的優(yōu)點(diǎn)就是不會(huì)產(chǎn)生探針自身退火；人工合成的寡核苷酸分子量小，穿透力大，且可在基因序列的多部位設(shè)計(jì)探針以選擇*序列；反義RNA探針是以DNA為模板轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈，特異性強(qiáng)，不存在探針自身退火的問題。
用于原位核酸雜交的探針既可用核素標(biāo)記，也可用非核素標(biāo)記。核素標(biāo)記的核酸探針敏感性高，但雜交信號(hào)的檢測(cè)有時(shí)需要較長的時(shí)間，如3H標(biāo)記的探針雜交曝光時(shí)間需要數(shù)周或數(shù)月。與放射性核素標(biāo)記的探針相比，非放射性探針具有安全、無放射性污染、穩(wěn)定性好、顯色快而易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，近年來得到了廣泛的應(yīng)用。
（四）雜交
在載玻片上進(jìn)行，雜交液的體積應(yīng)盡量小，一般每張切片用10～20／11雜交液。cDNA和RNA探針的雜交溫度大約為50℃。DNA探針的雜交可在2—4h內(nèi)完成，而RNA探針的雜交則應(yīng)過夜。如果靶分子是細(xì)胞內(nèi)的DNA，應(yīng)將組織切片加熱至95℃5—15min，使靶DNA變性。雜交后的沖洗溫度一般不高于50℃，以免使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞或脫落。用反義RNA探針雜交時(shí)，雜交后用RNA酶消化單鏈RNA以降低本底。
（五）雜交結(jié)果檢測(cè)
若應(yīng)用的是放射性核素標(biāo)記探針，雜交后必須經(jīng)過放射自顯影，對(duì)被檢測(cè)的核酸進(jìn)行定位與定量；若應(yīng)用的是非放射性標(biāo)記的探針，則根據(jù)標(biāo)記體系對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，例如生物素標(biāo)記的探針檢測(cè)主要用抗生物素抗體和親和素檢測(cè)。