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PCR診斷弓形蟲病
發布時間：2011-2-26PCR檢測 謝德華等（2005）以核糖體DNA*內轉錄間隔區（1TSl）序列作為弓形蟲種特異的遺傳標記，建立了豬弓形蟲病特異PCR診斷方法。
套式PCR（nestedPCR） 設計兩對引物，外引物含有內引物的部分序列，經兩次擴增，大大提高了PCR的敏感性和特異性。糜祖煌以兩對月J基因引物建立了套式PCR擴增弓形蟲基因，發現套式PCR比普通PCR敏感兩個數量級。Martinez等（2003）用套式PCR-ELISA檢測弓形蟲DNA，確定檢測閾值并與Southern印跡相對比，將雜交時間及探針濃度標準化，認為PCRELISA法可以作為弓形蟲常規檢測試驗。Vidigal等（2002）用套式PCP,檢測丁86例羊水，敏感度為62．5％，特異度為97．4％。Fuentes等（1996）報道以尿液進行嬰兒先天性弓形蟲病的產前診斷，用巢式PCR進行診斷，結果表明，在嬰兒先天性弓形蟲感染的確診中是一種非常有用的方法。鄭蘭艷等（2000）應用ELISA—PCR檢測弓形蟲循環抗原研究認為此方法是一種特異性強、敏感性高弓形蟲的檢測方法，其敏感性較ELISA方法提高了200倍并且認為此方法檢出陽性結果時間早等優點。另外，Jones等（2000）用P30、B1和rDNA三種靶序列來設計引物，通過套式PCR檢測眼房水弓形蟲DNA的方法來比較三者之間的敏感性，結果說明以月J基因作為靶基因的PCR是zui敏感的方法。
定量競爭PCR（quantitiativecompetitivePCR） 設計與目的基因有相同引物結合部位（同源性競爭模板）或有不同引物結合部位（異源性競爭模板）的內參照，通過擴增后內參照的DNA產物含量來推算標本中目的DNA或mRNA的含量。Lee（1999）設計了含4個引物結合位點的人工競爭物的定量競爭套式PCR檢測方法，競爭物可作為定量的參照，又可以檢測假陰性結果。Homan等（2000）用529bp重復序列作為靶基因檢測弓形蟲病原。
多重PCR（multiplexPCR） 為了同時檢測幾種病原體而在一個反應體系中加入多對引物以擴增不同的DNA片段，操作快速簡便。Roberts（1997）用多重PCR同時檢測AIDS患者腦脊液中弓形蟲及EB病毒，達到鑒別診斷的目的。
原位PCR（insitu PCR） 在組織切片或細胞涂片的原位對DNA或RNA進行擴增，將原位雜交的定位性與PCR的高敏感性結合起來，省卻了提取DNA的煩瑣步驟，可以同時觀察組織病變、進行蟲體定位、動態觀察蟲體的感染情況。李爽等（2000）用原位PCR方法檢測了10例弓形蟲感染的病理標本，陽性率100％。
熒光定量PCR（FQ-PCR） 可采用與DNA雙鏈特異性結合的熒光染料（SYBRGreen 1），熒光共振能量轉移（FRET）的雜交探針技術及水解探針模式（即Taqman技術）。探針熒光信號的強度隨基因量的增加而增加，從而達到定量的目的。試驗采用閉管操作，避免了后處理時易出現的污染；實時定量檢測克服了傳統PCR方法的平臺效應。Bretagne（2003）建立了實時PCR方法，自動抽提DNA，并將其標準化，使得實驗室間的結果對比及質量控制成為可能。Ma等（2003）用熒光定量PCR的方法檢測了70位感染弓形蟲的孕婦的羊水和／或臍帶血以診斷胎兒感染，證明了母親感染弓形蟲DNA含量越高，胎兒感染率越高。Lin等（2003）以寡核苷酸為引物，建立了以熒光標記的Taqman探針擴增弓形蟲B1基因的實時PCR方法，可以檢測出含o．05個速殖子的標本。
逆轉錄PCR（RTPCR） 以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，由人工合成的引物介導生成cDNA模板，在TaqDNA聚合酶作用下，擴增產生大量的特異性DNA片段。Cultrera等（2002）用RT—PCR檢測人標本中慢殖子的表達，從而區分急性感染或者慢性感染，擴增MAGl、SAG4、SAGl基因以達到區分不同感染階段的目的。