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酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測豬繁殖與呼吸綜合征
發布時間：2011-4-2
Albina等（1992）用PRRSV接種PAM培養，提取PRRSV抗原，建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA，當PRRSV抗原孔的OD值與細胞抗原孔的OD值之比大于1．5時，即判斷樣品為陽性。研究發現ELISA的特異性與IPMA相同，但敏感性更高。由于PAM為原代細胞，難以獲得足夠的細胞用于制備
PRRSV抗原，Takikawa等（1996）用PRRSV接種MARCl45細胞提取PRRSV抗原，建立了檢測PRRSV抗體的ELISA方法，結果表明，ELISA具有比IPMA和IFA更好的特異性和敏感性。由于用MAR~145制備的PRRSV抗原有一定程度的非特異性反應，因此有必要進一步改進。Cho等（1996）利用Triton-X100助溶，從PRRSV感染的MARC-145細胞中制備出高純度的E1．ISA抗原，這種高質量的抗原應用到檢測PRRSV抗體的間接ELISA中，輔以一種有效的封閉劑可消除血清樣品的非特異性反應，且這種ELISA比1FA敏感，特別是對感染后期血清具有高度的特異性；具有快速、經濟、敏感、適合大量樣品的檢測、可半自動和自動顯示結果等優點，明顯優于IPMA和IFA，目前ELISA已作為PRRS檢測診斷的常規手段。
當前，病毒病診斷技術的發展趨向于特異強、敏感性高、快速、經濟、操作安全簡單，能夠達到的早期診斷目的，適于大量樣品的檢測，而且診斷技術都趨向于試劑盒化，PRRS的診斷也不例外。目前，美國IDEXX公司生產用于PRRS的ELISA診斷試劑盒在世界范圍內得到了廣泛的應用，國內PRRS的診斷試劑盒的市場幾乎被美國IDEXX公司壟斷，而這種進口ELISA試劑盒價格昂貴，只有條件較好的豬場和實驗室才能負擔得起。然而，該ELISA試劑盒是用PRRSV全病毒包被酶標板（Steven，eta1，2000），因此，生產廠商要求使用完畢的試劑盒材料必須進行焚燒處理；如果在操作或處理上出現失誤，就會存在潛在散毒的危險，我國PRRS的流行也許與該試劑盒的引進和使用不當有關。所以，有必要研究安全不散毒、敏感性高特異性強的PRRSELISA診斷方法。
用重組蛋白作為靶抗原來建立血清學診斷方法就可避免散毒這一弊端，因PRRSV的N蛋白很保守并具有*的免疫原性，所以，在分子生物學基礎上建立起來的血清學檢測方法都是以原核或真核表達的重組N蛋白為基礎（Dea，eta1，2000b~Denac，eta1，1997~Steven，eta[，200％Meulenberg，etal，1995b）。Dea等（2000）用原核表達的重組N蛋白直接溶于4mol／L的鹽酸胍，用PBS稀釋后就可用于血清學方法的研究，成功地建立了檢測PRRSV抗體的ELlSA方法，在感染后的7～10天，可從血清內檢測出PRRSV抗體；與1DEXX公司商品化的ELISA診斷試劑盒同時檢測542份豬血清，二者檢測結果*一致；將5個表位全部（ORF7）或分段進行表達發現，只有完整的重組N蛋白（原核表達）才適合用于PRRS血清學診斷方法的研究（Dea，etal，2000b）。ORF7也有在桿狀病毒表達系統中獲得表達的報道，所建立的ELISA也顯示出較好的診斷效果，但桿狀病毒表達系統的表達量遠遠不及原核表達豐富，且所需試驗條件及成本高，并且昆蟲細胞培養時加入的胎牛血清易給血清學反應造成非特異性反應，因此，實際應用受到了限制（Denac，etal，1997~Steven，etal，2000）。國內研究者也對ORF7在兩個系統的表達進行了研究（仇華吉等，1999。；王云峰等，2000~趙耘等，2001），但沒有一個真正試劑盒化的方法出現并應用于PRRS的診斷。M蛋白是歐、美型PRRSV毒株之間zui保守的蛋白，且有較強的免疫原性，在感染后的第10天就可檢測出相應的抗體（Meng，etal，1995b~Loemba，etal，1996），因此，PRRSV的M蛋白同樣可作為PRRS診斷的靶抗原，但國內外還沒有將M蛋白進行表達研究和用于建立診斷方法的報道。如果將N蛋白與M蛋白進行融合表達，用重組蛋白MN建立的ELISA方法也許會得到更好的效果，這一方法值得探討。
PRRSV抗原，Takikawa等（1996）用PRRSV接種MARCl45細胞提取PRRSV抗原，建立了檢測PRRSV抗體的ELISA方法，結果表明，ELISA具有比IPMA和IFA更好的特異性和敏感性。由于用MAR~145制備的PRRSV抗原有一定程度的非特異性反應，因此有必要進一步改進。Cho等（1996）利用Triton-X100助溶，從PRRSV感染的MARC-145細胞中制備出高純度的E1．ISA抗原，這種高質量的抗原應用到檢測PRRSV抗體的間接ELISA中，輔以一種有效的封閉劑可消除血清樣品的非特異性反應，且這種ELISA比1FA敏感，特別是對感染后期血清具有高度的特異性；具有快速、經濟、敏感、適合大量樣品的檢測、可半自動和自動顯示結果等優點，明顯優于IPMA和IFA，目前ELISA已作為PRRS檢測診斷的常規手段。
當前，病毒病診斷技術的發展趨向于特異強、敏感性高、快速、經濟、操作安全簡單，能夠達到的早期診斷目的，適于大量樣品的檢測，而且診斷技術都趨向于試劑盒化，PRRS的診斷也不例外。目前，美國IDEXX公司生產用于PRRS的ELISA診斷試劑盒在世界范圍內得到了廣泛的應用，國內PRRS的診斷試劑盒的市場幾乎被美國IDEXX公司壟斷，而這種進口ELISA試劑盒價格昂貴，只有條件較好的豬場和實驗室才能負擔得起。然而，該ELISA試劑盒是用PRRSV全病毒包被酶標板（Steven，eta1，2000），因此，生產廠商要求使用完畢的試劑盒材料必須進行焚燒處理；如果在操作或處理上出現失誤，就會存在潛在散毒的危險，我國PRRS的流行也許與該試劑盒的引進和使用不當有關。所以，有必要研究安全不散毒、敏感性高特異性強的PRRSELISA診斷方法。
用重組蛋白作為靶抗原來建立血清學診斷方法就可避免散毒這一弊端，因PRRSV的N蛋白很保守并具有*的免疫原性，所以，在分子生物學基礎上建立起來的血清學檢測方法都是以原核或真核表達的重組N蛋白為基礎（Dea，eta1，2000b~Denac，eta1，1997~Steven，eta[，200％Meulenberg，etal，1995b）。Dea等（2000）用原核表達的重組N蛋白直接溶于4mol／L的鹽酸胍，用PBS稀釋后就可用于血清學方法的研究，成功地建立了檢測PRRSV抗體的ELlSA方法，在感染后的7～10天，可從血清內檢測出PRRSV抗體；與1DEXX公司商品化的ELISA診斷試劑盒同時檢測542份豬血清，二者檢測結果*一致；將5個表位全部（ORF7）或分段進行表達發現，只有完整的重組N蛋白（原核表達）才適合用于PRRS血清學診斷方法的研究（Dea，etal，2000b）。ORF7也有在桿狀病毒表達系統中獲得表達的報道，所建立的ELISA也顯示出較好的診斷效果，但桿狀病毒表達系統的表達量遠遠不及原核表達豐富，且所需試驗條件及成本高，并且昆蟲細胞培養時加入的胎牛血清易給血清學反應造成非特異性反應，因此，實際應用受到了限制（Denac，etal，1997~Steven，etal，2000）。國內研究者也對ORF7在兩個系統的表達進行了研究（仇華吉等，1999。；王云峰等，2000~趙耘等，2001），但沒有一個真正試劑盒化的方法出現并應用于PRRS的診斷。M蛋白是歐、美型PRRSV毒株之間zui保守的蛋白，且有較強的免疫原性，在感染后的第10天就可檢測出相應的抗體（Meng，etal，1995b~Loemba，etal，1996），因此，PRRSV的M蛋白同樣可作為PRRS診斷的靶抗原，但國內外還沒有將M蛋白進行表達研究和用于建立診斷方法的報道。如果將N蛋白與M蛋白進行融合表達，用重組蛋白MN建立的ELISA方法也許會得到更好的效果，這一方法值得探討。