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產氣莢膜梭菌病診斷技術
發布時間：2011-4-21
（1）檢樣中腸毒素檢測取腹瀉糞便加入生理鹽水做成1：10的乳劑，離心后取上清液置微量U形底孔反應板上。以二倍遞增稀釋法稀釋，做成以下三列。
*列：檢樣稀釋液+致敏紅細胞（或致敏乳膠粒）。
第二列：檢樣稀釋液+未致敏的紅細胞（或未致敏的乳膠粒）。
第三列：已知量的腸毒素稀釋液+致敏紅細胞（或致敏乳膠粒）。
RPHA在2h，RPLA在5～10h后進行凝集判斷。若*列與第二列反應陽性的終點相同，則認為有非特異性凝集存在。在這種情況下，可于檢樣中加入等量的50％未致敏的血細胞（或乳膠粒）進行吸收后離心，取上清液再次進行試驗。確定非特異性凝集吸收后，即可與第三列對照作比較，計算出毒素含量。
（2）培養液中腸毒素測定在產氣莢膜芽孢形成初期的菌體中含有腸毒素，當芽孢成熟，菌體崩解時即游離到培養液中。因此可用產芽孢培養基24～48h培養后，用超聲波或溶菌酶處理，破壞菌體，離心所得到的上清液作檢樣。芽孢形成可用相差顯微鏡查明。腸毒素測定方法可用RPHA或RPLA。對培養液中腸毒素用RPHA或RPLA檢測時，幾乎看不到非特異性反應。
（3）分離菌腸毒素產生性試驗產氣莢膜梭菌在試管內不易形成芽孢，故有時即使為食物中毒菌A型、C型或D型，也有看不到芽孢、測不到腸毒素的情形。常給予75~C20min的反復熱刺激促使芽孢形成，并用促芽孢培養基。分離菌的腸毒素產生試驗程序如下。
被檢菌液0．1-0．5ml，接種庖肉培養基，置37~C2～4h后，進行75℃20min熱水浴處理，取出再置37~C2-4h再進行熱處理。必要時可重復3～4次。取出0．1-0．5ml轉種于硫乙醇鈉培養基37~C6h，再接種促芽孢培養基37~C72h，取少許涂片鏡檢·，觀察有無芽孢形成。若見到芽孢可進行腸毒素測定。
（4）其他毒素測定。從食品檢樣中提取毒素可以25g無脂肪檢樣在lOOmlHEPES[N-（2-hydroxyethyl）peraz洫e-N，-2-ethaesulfonicacid]緩沖液中，以300r／min絞切1rain。將勻質物在5℃下，以20000r／min離心20min。取上清置冰箱內1～2h，用濾膜濾器濾過滅菌。置濾液于透析袋內，在15％一30％聚乙烯乙二醇（相對分子質量為20000）透析到少于lOml。可供下述各項試驗用。
溶血試驗取o．5ml10．5％綿羊紅細胞懸液于小試管內，加上述毒素抽提液0．5ml，置37℃水浴中經30min、60min、120min和24h，分別觀察溶血情況。
致死試驗取0．2ml毒素抽提液注射幾只小白鼠尾靜脈內（或腹腔內注射o．5m1），觀察3天，看其有無死亡。
壞死試驗以o．2ml毒素抽提液注射于家兔腹部皮下，連續3天觀察注射局部有無壞死現象。
將毒素抽提液以0．5ml量分別與0．5ml抗產氣莢膜梭菌的標準血清（主要是A型至E型的抗毒素）混合，然后注射于小白鼠腹腔內，觀察3天，看注射小鼠有無死亡。根據注射小鼠被動保護作用，確定毒素型別。
注：HEPES緩沖液使用濃度一般為10-50mmol／L，可以根據緩沖液能力的要求而定。
10mmol／LHEPES的配制，稱取0．2385gHEPES，加入到l00ml培養液內溶解，用lmol／L氫氧化鈉調至pH7．o～7．2，過濾除菌后使用。
*列：檢樣稀釋液+致敏紅細胞（或致敏乳膠粒）。
第二列：檢樣稀釋液+未致敏的紅細胞（或未致敏的乳膠粒）。
第三列：已知量的腸毒素稀釋液+致敏紅細胞（或致敏乳膠粒）。
RPHA在2h，RPLA在5～10h后進行凝集判斷。若*列與第二列反應陽性的終點相同，則認為有非特異性凝集存在。在這種情況下，可于檢樣中加入等量的50％未致敏的血細胞（或乳膠粒）進行吸收后離心，取上清液再次進行試驗。確定非特異性凝集吸收后，即可與第三列對照作比較，計算出毒素含量。
（2）培養液中腸毒素測定在產氣莢膜芽孢形成初期的菌體中含有腸毒素，當芽孢成熟，菌體崩解時即游離到培養液中。因此可用產芽孢培養基24～48h培養后，用超聲波或溶菌酶處理，破壞菌體，離心所得到的上清液作檢樣。芽孢形成可用相差顯微鏡查明。腸毒素測定方法可用RPHA或RPLA。對培養液中腸毒素用RPHA或RPLA檢測時，幾乎看不到非特異性反應。
（3）分離菌腸毒素產生性試驗產氣莢膜梭菌在試管內不易形成芽孢，故有時即使為食物中毒菌A型、C型或D型，也有看不到芽孢、測不到腸毒素的情形。常給予75~C20min的反復熱刺激促使芽孢形成，并用促芽孢培養基。分離菌的腸毒素產生試驗程序如下。
被檢菌液0．1-0．5ml，接種庖肉培養基，置37~C2～4h后，進行75℃20min熱水浴處理，取出再置37~C2-4h再進行熱處理。必要時可重復3～4次。取出0．1-0．5ml轉種于硫乙醇鈉培養基37~C6h，再接種促芽孢培養基37~C72h，取少許涂片鏡檢·，觀察有無芽孢形成。若見到芽孢可進行腸毒素測定。
（4）其他毒素測定。從食品檢樣中提取毒素可以25g無脂肪檢樣在lOOmlHEPES[N-（2-hydroxyethyl）peraz洫e-N，-2-ethaesulfonicacid]緩沖液中，以300r／min絞切1rain。將勻質物在5℃下，以20000r／min離心20min。取上清置冰箱內1～2h，用濾膜濾器濾過滅菌。置濾液于透析袋內，在15％一30％聚乙烯乙二醇（相對分子質量為20000）透析到少于lOml。可供下述各項試驗用。
溶血試驗取o．5ml10．5％綿羊紅細胞懸液于小試管內，加上述毒素抽提液0．5ml，置37℃水浴中經30min、60min、120min和24h，分別觀察溶血情況。
致死試驗取0．2ml毒素抽提液注射幾只小白鼠尾靜脈內（或腹腔內注射o．5m1），觀察3天，看其有無死亡。
壞死試驗以o．2ml毒素抽提液注射于家兔腹部皮下，連續3天觀察注射局部有無壞死現象。
將毒素抽提液以0．5ml量分別與0．5ml抗產氣莢膜梭菌的標準血清（主要是A型至E型的抗毒素）混合，然后注射于小白鼠腹腔內，觀察3天，看注射小鼠有無死亡。根據注射小鼠被動保護作用，確定毒素型別。
注：HEPES緩沖液使用濃度一般為10-50mmol／L，可以根據緩沖液能力的要求而定。
10mmol／LHEPES的配制，稱取0．2385gHEPES，加入到l00ml培養液內溶解，用lmol／L氫氧化鈉調至pH7．o～7．2，過濾除菌后使用。