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培養(yǎng)細胞的免疫酶標抗體染色法
發(fā)布時間：2012-2-16
免疫酶組織化學技術(shù)是以酶作為抗原抗體反應的標記物，酶催化相應的底物，形成一種不溶性的反應產(chǎn)物。光鏡觀察時，要求形成的終產(chǎn)物為不溶性的有色沉淀，而電鏡觀察時，則要求酶反應的終產(chǎn)物經(jīng)適當處理后，具有較高的電子密度。辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)是目前應用zui多的酶標記物，具有穩(wěn)定性強和酶反應特異性高等優(yōu)點。
1)0．1mol／LPB(pH7．2)配制的4％多聚甲醛原位固定(4℃)1小時；
2)2％H2O2／甲醇處理(可省略)，室溫20分鐘，封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性；
3)PBS漂洗后1％BSA室溫孵育15分鐘；
4)特異性抗體(*抗體)室溫孵育3小時或4℃孵育過夜；
5)PBS充分漂洗后，HRP或生物素標記的第二抗體室溫孵育30—60分鐘，如系生物素標記的第二抗體，反應后則需進一步按ABC試劑盒要求操作；
6)PBS漂洗后，1％戊二醛0．1m01／LPB配制固定30—60分鐘，PBS漂洗；
7)呈色反應：0．03％～0．05％DAB0．0l％H>(L／0．05mol／LTris—HCl(pH7．6)顯色，適時終止反應，PBS漂洗；
8)1％OsO4后固定30～60分鐘；
9)樣品的脫水、原位包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等與常規(guī)電鏡相同。
培養(yǎng)細胞的免疫酶標抗體染色法電鏡圖
顯示胸腺細胞表面：thy1.2抗原分布(箭頭所示)
1)0．1mol／LPB(pH7．2)配制的4％多聚甲醛原位固定(4℃)1小時；
2)2％H2O2／甲醇處理(可省略)，室溫20分鐘，封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性；
3)PBS漂洗后1％BSA室溫孵育15分鐘；
4)特異性抗體(*抗體)室溫孵育3小時或4℃孵育過夜；
5)PBS充分漂洗后，HRP或生物素標記的第二抗體室溫孵育30—60分鐘，如系生物素標記的第二抗體，反應后則需進一步按ABC試劑盒要求操作；
6)PBS漂洗后，1％戊二醛0．1m01／LPB配制固定30—60分鐘，PBS漂洗；
7)呈色反應：0．03％～0．05％DAB0．0l％H>(L／0．05mol／LTris—HCl(pH7．6)顯色，適時終止反應，PBS漂洗；
8)1％OsO4后固定30～60分鐘；
9)樣品的脫水、原位包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等與常規(guī)電鏡相同。
培養(yǎng)細胞的免疫酶標抗體染色法電鏡圖
顯示胸腺細胞表面：thy1.2抗原分布(箭頭所示)