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【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】
1.溶菌酶Y活性檢測(cè)
⑴ 酶活力測(cè)定方法
⑵ 酶活力單位定義
⑶ 比活力定義
⑷ 蛋白含量測(cè)定方法
2. 蛋清溶菌酶的提取
⑴ 每組4～5個(gè)新鮮雞蛋
⑵ 利用等電點(diǎn)沉淀及樹(shù)脂層析等方法進(jìn)行溶菌酶提取
3. 溶菌酶的分離、純化
⑴ 利用各種方法，從上述提取液分離
⑵ 每步純化前蛋白純度檢測(cè)
⑶ 分離純化過(guò)程中跟蹤檢測(cè)活性組份的蛋白質(zhì)含量和酶活性
4. 溶菌酶理化性質(zhì)
⑴ 溶菌酶的分子量測(cè)定
⑵ 溶菌酶的等電點(diǎn)測(cè)定
5. 溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)
⑴ 在活力單位定義確定后，求出溶菌酶的Vmax和Km
⑵ 初步確定溶菌酶的zui適pH
⑶ 初步確定溶菌酶的zui適溫度
⑷ 提出zui少兩種溶菌酶的可逆抑制劑并驗(yàn)證抑制類(lèi)型
⑸ 提出溶菌酶的激活性并驗(yàn)證
（6） 溶菌酶的熱穩(wěn)定性

【實(shí)驗(yàn)原理】
溶菌酶（lysozyme）是由弗萊明在1922年發(fā)現(xiàn)的，它是一種有效的抗菌劑，全稱(chēng)為 1，4-β-N-溶菌酶，又稱(chēng)作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁質(zhì)酶。活性中心為天冬氨酸52和谷氨酸35，是一種糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N- 乙酰氨基葡萄糖（NAG）與N-乙酰胞壁酸（NAM）間的β-1，4糖苷鍵，相對(duì)分子質(zhì)量14700Da，由129氨基酸 殘基構(gòu)成，由于其中含有較多堿性氨基酸 殘基，所以其等電點(diǎn)高達(dá)10.8左右，zui適溫度為50OC，zui適PH為6～7左右。在280nm的消光系數(shù) 為 13.0。該酶活性可被一些金屬離子Cu2+ ，F(xiàn)e2+ ，Zn2+ （10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+ ,Ca2+ （10-5～10-3M）、NaCl所激活。
　　溶菌酶廣泛存在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)，雞蛋（含量約為2%～4%）和哺乳動(dòng)物的乳汁是溶菌酶的主要來(lái)源，目前，溶菌酶仍屬于緊銷(xiāo)的生化物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床，具有抗感染、消炎、消腫、增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)等多種藥理作用。
溶菌酶常溫下在中性鹽溶液 中具有較高天然活性 ，在中性條件下溶菌酶帶正電荷，因此在分離制備時(shí)，先后采用等電點(diǎn)法，D152型樹(shù)脂柱層析法除雜蛋白，再經(jīng)Sephadex G-50層析柱進(jìn)一步純化。zui后用SDS -PAGE 鑒定為一條帶。采用福林酚法測(cè)蛋白含量，分光光度法測(cè)定酶活性。

【實(shí)驗(yàn)材料】
1.實(shí)驗(yàn)器材
循環(huán)水式真空泵 HSB-IⅡ; 蛋白紫外檢測(cè)儀; 記錄儀; 紫外分光光度計(jì) ; 梯度混合器（500mL）; 721型光分光光度計(jì) ; 冰凍離心機(jī) ；冰箱；透析袋 ；酸度計(jì) ；部分收集器；恒流泵；圓盤(pán)電泳裝置；恒溫水浴 鍋；層析柱（2.6×50cm）（1.6×30cm）；布氏漏斗 （500mL）；吸濾瓶 （1000mL）；G-3砂芯漏斗 （500mL）
2．實(shí)驗(yàn)試劑
⑴ 雞蛋清（鮮雞蛋）
⑵ 底物微球菌粉
⑶ D152大孔弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂
⑷ 固體（NaCl）；固體硫酸銨（NH4 ）2 SO4 ；固體磷酸氫二鈉（Na2 HPO4 ·12H2 O）；固體磷酸二氫鈉（NaH2 PO4 ·2H2 O）；固體磷酸鈉（Na3 PO4 ）
⑸ 乙醇；蒸餾 水；甲醇；考馬斯亮藍(lán)；三氯醋酸；丙酮
（6） 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品；Sephadex G50
⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸銅；硫酸亞鐵；硫酸鋅；氯化鎂；氯化鈣；氫氧化鈉；鹽酸
⑻ SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑;蛋白含量測(cè)定（福林法）試劑
⑼ 聚乙二醇-20000、兩性電解質(zhì)

【實(shí)驗(yàn)操作】
1.蛋清的制備
將4～5個(gè)新鮮的雞蛋兩端各敲一個(gè)小洞，使蛋清流出（雞蛋清pH 值不得小于8），輕輕攪拌5分鐘，使雞蛋清的稠度均勻，用兩層紗布過(guò)濾除去臍帶塊，量體積約為100ml.