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細胞培養技術服務

1、 細胞培養服務流程

① 從動物組織切割、分離所需培養的組織(原代培養);

② 用滅菌PBS多次清洗組織，充分剪碎組織，用滅菌PBS清洗組織;

③ 靜置數分鐘，使組織沉淀于管底，棄上清;

④ 胰蛋白酶充分消化組織，棄上清;

⑤ 加入含小牛血清或胎牛血清的培養基，置于CO2培養箱培養;

⑥ 從CO2培養箱取出生長狀態良好的單層原代培養細胞或傳代培養細胞，于超凈工作臺中棄去培養液，用滅菌PBS清洗;

⑦ 加入適量胰蛋白酶消化液，靜置片刻;

⑧ 倒置顯微鏡下觀察細胞消化狀態，如變圓，立即棄去消化液，加入培養液終止消化;

⑨ 終止培養，去除培養上清液;

⑩ 反復吹打培養液，制成單細胞懸液，分置于多個細胞培養瓶/皿，進行傳代培養;

注：①～⑤為原代細胞培養主要步驟，⑥～⑩為傳代細胞培養主要步驟。

圖1細胞培養流程

2、 細胞培養的原理

細胞培養(cell culture)或組織培養是指把從活體取出的組織細胞，在人工建立的無菌、適當溫度和營養的條件下，模擬其在體內的生長環境使其增殖或分化，并維持結構和功能的一種技術。該技術可從細胞或亞細胞水平幫助人類揭示其生、老、病、死的有關規律，探索優生、抗衰老、防治疾病的手段或途徑，人為地誘導細胞遺傳性狀的改變，使其向更有利于人類和自然界的方向發展。其中狹義的細胞培養是指：單個細胞或細胞群在體外用人工建立的無菌、合適的溫度和營養以及酸堿度適當的條件下，使其生存生長的一種操作技術。而組織培養( tissue culture)是指在營養及溫度等適當的條件下維持組織在體外生長的一種操作方法。在習慣上也泛指所有的體外培養，即器官培養、組織培養和細胞培養的總稱。組織培養是20世紀初[Harrison, 1907; Carrel, 1912]才創建的一種研究動物細胞行為的方法，那時只是為了避開因正常的體內自體調節以及實驗應激所可能產生的機體整體因素的影響。原代細胞培養也稱初代細胞培養，是從供體直接取材獲取細胞后在體外進行的培養。這是建立各種細胞系( cell line)的*步和基礎，。在此期間，細胞的生物學性狀尚未發生很大變化，仍具有二倍體遺傳特性，在一定程度上能反映體內狀態。此期細胞呈活躍狀態，可見細胞分裂但不旺盛。原代細胞培養多由各種細胞成分組成，比較復雜，即使是經過處理后的細胞，也仍具有異質性,主要表現在細胞形態和大小不一。傳代細胞培養是指原代培養細胞一般經過1～4周的培養后，將細胞從一個培養瓶轉移養瓶的分離過程。在傳代期，細胞一般增殖旺盛，并能維持二倍體核型，大多數二倍體細胞在培養中維持有限生存期，體外zui多生存1年左右，傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期。為保持二倍體細胞的特性，細胞應在初代培養期或傳代培養早期將部分細胞低溫保存，以防污染等的丟失并備用。

3、 細胞培養優點

① 理化環境的調控：pH、溫度、滲透壓、O2和CO2的氣壓，它們受到非常的調節;

② 生理條件可以保持相對恒定：生理條件雖然不能總是被地界定，但可以保持相對恒定，大多數細胞系的培養仍然需要在培養基中添加血清或其他尚未被確認的成分;

③ 樣品的特征和均一性：組織樣品的異質性( heterogeneous)不可避免，但經過一次或兩次傳代以后，培養的細胞系會呈現為均一性的(或至少具有相同性質的)構成。這是因為每次傳代時細胞隨機混合，培養條件的選擇性壓力利于zui有活力的細胞生長，進而產生性質較均一的培養物;

④ 經濟、規模和機械化;細胞培養些對種種物質的篩選和重復性試驗都較便宜，并且還避免了動物實驗所存在的法律、道德和倫理問題，多孔培養板和自動化技術方面的新進展也使組織培養在時間和規模上都更加經濟有效;

⑤ 體內環境的體外模擬：灌注培養技術使特殊實驗成分的釋放在濃度、作用時間及代謝狀態方面到控制。

4、 細胞培養缺點：

① 需要具備專業技能：培養技術必須在嚴格的無菌條件下進行，因為動物細胞的生物，如細菌、真菌、酵母的生長都要慢得多，這就需要操作者具備一定的技術與知識水平;

② 產量有限：細胞培養的一個主要局限性在于所付出的努力和物質只能生產出相當少的一些組織，對于絕大多數小實驗室(只有兩個或三個人從事組織培養)，每批的實際zui大產量可能只有l～10g細胞，100g以上的產量則意味著達到了企業化的小規模生產水平，這就意味著大多數實驗室難達到規模化生產;

③ 去分化和選擇：許多科學家發現經過幾代的培養，細胞系容易喪失了其來源組織細胞的*表型特征，即去分化;

④ 細胞的起源：不論是什么原因，如果細胞喪失了分化的特性，就很難將培養的細胞與其來源組織中有功能的細胞起來;

⑤ 不穩定性：不穩定性是許多連續性細胞系(continuous cell line)所面臨的主要問題，這是由于它們非整倍的染色體組成不穩定所導致的。

5、 培養細胞的生長特性

① 貼壁型細胞：大多數的活體體內細胞在體外培養時都需貼附在支持物上生長，這種生長方式稱為貼附依賴性細胞，也稱錨著依存性細胞，一般可分成以下3類：

a:上皮細胞型;

b:成纖維細胞型;

c:游走細胞型;

② 懸浮型細胞:在體外培養時，少數類型的細胞呈懸浮狀態生長，在瓶皿內不貼壁，其生存空間大，能繁殖大量細胞，容易進行傳代培養，但在觀察細胞病變時不如貼壁細胞,如血液中的淋巴細胞、白細胞、脾、骨髓細胞以及某些腫瘤細胞等均屬于此型細胞，觀察時的形態多呈圓形;

6、 培養細胞所需材料

① 培養細胞試劑：

a:培養液，如MEM、DMEM、IMDM、RPMI1640等;

b:胎牛血清或小牛血清;

e:PBS緩沖液;

f:胰蛋白酶消化液;

② 培養細胞耗材：

a:組織或傳代培養細胞;

b:細胞培養瓶/皿、離心管、細胞培養板;

c:無菌的tip頭、吸管、滴管、吹打管;

d:刀、剪、鑷等解剖用具(用于原代培養);

e:乙醇(用于原代培養);

f:細胞計數器;

g:細胞凍存管;

③ 儀器設備：

a: CO2培養箱(圖2);

b:恒溫水浴箱(圖3);

c:高壓蒸氣滅菌器;

d:玻璃濾器和微量超濾膜濾器;

e:離心機;

f:液氮罐;

g:無菌操作室和超凈工作臺(圖4);

h:普通顯微鏡、倒置顯微鏡等;

圖2 CO2培養箱 圖3恒溫水浴箱 圖4超凈工作臺

7、 材料要求

① 組織取材、切割等過程中充分清洗;

② 干凈組織量新鮮;

③ 避免組織\細胞污染;

④ 實驗材料涉及危險品，loogene公司不予服務;

⑤ 提供盡量詳細的實驗背景材料。

8、 實驗周期

① 1-10個樣本，20個工作日

② 10-100個樣本，30個工作日

③ 100個樣本以上，60個工作日

注：根據原代細胞培養或傳代細胞培養以及細胞本身特性不同，實驗時間有較大差異。

9、 提供結果

完整的實驗操作步驟、對數生長期細胞或凍存狀態的細胞、原代培養細胞、顯微鏡下細胞生長狀態圖(圖5)等結果。

圖5 細胞生長狀態