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免疫共沉淀技術服務

1、 免疫共沉淀服務流程

① 收集培養的細胞(1×107～1×108);

② 用細胞裂解液裂解細胞

③ 冷凍離心機離心，取上清;

④ 加入相應抗體，溫育過夜;

⑤ 預處理protein A瓊脂糖珠;

⑥ 將預處理過的protein A瓊脂糖珠加入到上述液體，溫育;

⑦ 低速離心，將瓊脂糖珠離心至管底;

⑧ SDS-PAGE、Western印跡或質譜儀分析。

注：以上流程是以Protein A瓊脂糖珠法為例，根據免疫共沉淀方法不同，操作步驟有所區別。

圖1 免疫共沉淀流程

2、 免疫共沉淀原理

免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原和抗體的特異性結合以及細菌的Protein A或G特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的現象開發出來的方法。Co-IP是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。免疫共沉淀技術基本原理是細胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復合物，經過洗脫，收集免疫復合物，然后進行SDS-PAGE及Western印跡分析。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質問的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合，也可用于確定某一特定蛋白質新的作用輔助方法(圖2)。

圖2免疫共沉淀原理

3、 免疫熒光分類

① Protein A瓊脂糖珠法;

② Protein G-Sepharose法;

③ 已知抗體蛋白耦聯磁珠法;

4、 免疫共沉淀優缺點：

① 免疫共沉淀優點：

a: 蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的，可以避免人為的影響;

b: 可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物;

c: 相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態;

② 免疫共沉淀缺點：

a: 兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用;

b: 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質—蛋白質相互作用;

c: 實驗具有不確定性：實驗前預測目的蛋白以選擇檢測的抗體，若預測不正確，實驗就得不到結果。

5、 免疫共沉淀所需材料

(以Protein A瓊脂糖珠法為例)

① 免疫共沉淀試劑：

a: SDS-PAGE制膠緩沖液;

b: SDS-PAGE電泳緩沖液;

c: Loading Buffer;

d:考馬斯亮藍或硝酸銀;

e:考馬斯亮藍脫色液或銀染脫色液;

f: PBS緩沖液;

② 免疫共沉淀耗材：

a: 待檢樣本(培養細胞);

b:細胞裂解液;

c: Protein A瓊脂糖珠;

d:丙烯酰胺;

e: N,N,-甲叉雙丙烯酰胺;

③ 儀器：

a: 質譜分析儀;

b: 蛋白質電泳槽裝置;

c: 蛋白質電泳儀;

d: 臺式冷凍離心機;

圖3蛋白質電泳槽圖 圖4臺式冷凍離心機

6、 材料要求

① 避免細胞污染;

② 收集細胞時，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用;

③ 實驗材料涉及危險品，loogene公司不予服務;

④ 待檢細胞盡量新鮮，待測細胞生長狀態良好;

⑤ 提供盡量詳細的實驗背景材料;

⑥ 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。

7、 實驗周期

① 1-10個樣本，10個工作日

② 10-100個樣本，20個工作日

③ 100個樣本以上，40個工作日

8、 提供結果

完整的實驗操作步驟、SDS-PAGE、Western印跡(圖5)或質譜分析結果。

圖5 Western印跡