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范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群的快速檢驗(yàn)和計(jì)數(shù)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸菌群的快速檢驗(yàn)和計(jì)數(shù)。

規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB 4 78 9.3 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定

GB 4 78 9.28 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑

ISO 4 83 2:1991(E) 微生物學(xué)— 大腸菌群菌落計(jì)數(shù)法通則

術(shù)語和定義

下 列 術(shù) 語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)

3.1

大腸菌群coliform bacteria

大腸菌群是革蘭氏陰性、無芽抱、氧化酶陰性的桿狀細(xì)菌，為需氧和兼性厭氧，可在有膽鹽(或具有其他抑制生長的表面活性劑)存在的情況下生長，通常可在36℃士2℃發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸和醛。具有件半乳糖昔酶。在本標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的條件下，大腸菌群為能分解R-半乳糖昔、使培養(yǎng)基發(fā)出熒光或生成紫色(或紅色)菌落的一群革蘭氏陰性無芽抱桿菌。

4 原理

4.1 zui可能數(shù)(MPN)法

大 腸 菌 群可產(chǎn)生各半乳糖昔酶，分解液體培養(yǎng)基中的酶底物—4一甲基傘形酮一各D一半乳糖普(以下簡稱MUGaD，使4一甲基傘形酮游離，因而，在波長366 nm的紫外光燈照射下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。

4.2 平板法

大腸菌群可產(chǎn)生件半乳糖昔酶，分解培養(yǎng)基中的酶底物— 茜素一份D-半乳糖昔(以下簡稱Alizgal)，使茜素游離并與固體培養(yǎng)基中的鋁、鉀、鐵、錢離子結(jié)合形成紫色(或紅色)的鰲合物，使菌落呈現(xiàn)相應(yīng)的顏色。

試劑和培養(yǎng)基

5.1 磷酸鹽緩沖液

按 GB 4 789.28-1994中3.22規(guī)定進(jìn)行制備。

5.2 生理鹽水

5.2.1 成分

氯化鈉 8.5g

蒸 餾 水 10 00m L

5.2.2 制法

將氯化鈉溶于蒸餾水，121'C蒸汽滅菌15m in,

5.3 MUGal肉湯

5.3.1 成分

胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g

氯化鈉 5.0 g

無水磷酸氫二鉀2.75 g

無水磷酸二氫鉀2.75 g

月桂基硫酸鈉0.1g

MU G .I (純度不低于99%) 0. 08 g

蒸餾水 1000m L

5.3.2 制法

將各成分加熱溶于蒸餾水中，以15% 20腸氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值，分裝于20m mX 1 50m m試管，每管9 mL,116"C蒸汽滅菌10 min，zui終pH值7.0-7.2。待培養(yǎng)基冷卻后，以無菌手續(xù)于每管培養(yǎng)液內(nèi)加人0.1 m L經(jīng)無菌水稀釋的500p g/mL頭抱磺徒液或于10 00m L滅菌培養(yǎng)液內(nèi)加1m L經(jīng)無菌水稀釋的5 mg/mL頭抱磺吮液并以無菌操作分裝試管。

注 :雙 料 MUGal肉湯除燕餾水外，其他成分加倍。

5.4 Aliz-gal瓊脂

5.4.1 成分

胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g

氯化鈉 5.0 g

無水磷酸氫二鉀2.75 g

無水磷酸二氫鉀2.75 g

月桂基硫酸鈉0.1g

Aliz-gal (純度不低于97寫) 0.05 g

異丙基硫代半乳糖昔0.03g

硫酸鋁鉀 0.5 g

檸檬酸鐵錢0.5 g

瓊脂 15.0 g

蒸餾水 1000m L

5.4.2 制法

將各成分放入蒸餾水中，加熱使溶化，以15%~ 2 0%NaOH調(diào)整pH值，分裝燒瓶,1160C燕汽滅菌10m in，zui終pH值7.0-7.2 

6 設(shè)備和器材

培養(yǎng)箱:37℃士10℃

冷藏箱:0℃士4℃

天平:感量0.01 g

均質(zhì)器或乳缽。

平皿:直徑90 mm,

試管:20 mm ×150 mm.

吸管:1.0 ml一和10.0 ml。

廣口瓶或三角瓶:容量500 ml

玻璃珠:直徑約5 mm

試管架

紫外燈(波長366 nm)

其 他

7檢驗(yàn)程序

8 樣品的制備

8.1 以無菌手續(xù)取25 mL(或25 g)樣品，加于含225 mL無菌磷酸鹽緩沖液(或生理鹽水)的廣口瓶

(或三角瓶)內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，充分振搖或用均質(zhì)器以8000r/m-10000 r/m均質(zhì)1 min成1：10稀釋液。

8.2 用1m L無菌吸管吸取1，10樣品稀釋液1.0 m L，注人含9.0 m L無菌磷酸鹽緩沖液(或生理鹽水)的試管內(nèi)，振搖均勻，即成1，10。樣品稀釋液。

8.3 另取1. 0 mL無菌吸管，按上法制備10倍遞增樣品稀釋液。每遞增一次，換一支1. 0 mL無菌吸管。

8.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)悠肺廴境潭鹊墓烙?jì)，選擇三個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管培養(yǎng)基(MPN 法)或兩個(gè)平皿(平板法)。

9 大腸菌群的MPN計(jì)數(shù)

9.1 將待檢樣品和樣品稀釋液接種MUGal肉湯管，每管1. 0 mL(接種量在1. 0 mL以上者，接種雙料MUGal肉湯管)。每個(gè)樣品接種三個(gè)連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管培養(yǎng)基。同時(shí)另取2支MUGal肉湯管(或雙料MUGal肉湯管)加人與樣品稀釋液等量的上述無菌磷酸鹽緩沖液(或生理鹽水)作空白對(duì)照。

9.2 將接種后的培養(yǎng)管置于3TC士1'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h-24 h

9.3 將培養(yǎng)管置于暗處，用波長366 nm的紫外光燈照射，如顯藍(lán)色熒光，為大腸菌群陽性管;如未顯藍(lán)色熒光，則為大腸菌群陰性管。

9.4 結(jié)果報(bào)告:根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，查MPN表(見附錄A)，報(bào)告每100 m工(g)食品中大腸菌群MPN值。

10 大腸菌群的菌落計(jì)數(shù)

10.1 用滅菌吸管吸取待檢樣液1. 0 mL，加人無菌平皿內(nèi)。每個(gè)樣品接種三個(gè)連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)平皿。

10.2 于每個(gè)加樣平皿內(nèi)傾注巧mL45 C~ 50℃的Aiiz-gal瓊脂，迅速輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使混合均勻。待瓊脂凝固后，再傾注3 mL-5 mL Aliz-gal瓊脂覆蓋表面。同時(shí)將Aliz-gal瓊脂傾人加有1 mL上述無菌磷酸鹽緩沖液(或生理鹽水)的無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。

10.3 待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，于37℃士1'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h-24 h。取出平板，計(jì)數(shù)紫色(或紅色)菌落。

10.4 結(jié)果報(bào)告

10-4.1 當(dāng)平板上的紫色(或紅色)菌落數(shù)不高于150個(gè)，且其中至少有一個(gè)平板紫色(或紅色)菌落不少于15個(gè)時(shí)，按式(1)計(jì)算大腸菌群數(shù)：N=∑C/(n1+n2)d

式 中 :

N — 樣品的大腸菌群數(shù)，個(gè)/mL或g;

∑C — 所有計(jì)數(shù)平板上，紫色(或紅色)菌落數(shù)之總和;

n1 — 供計(jì)數(shù)的zui低稀釋倍數(shù)的平板數(shù);

n2 — 供計(jì)數(shù)的高一稀釋倍數(shù)的平板數(shù);

d— 供計(jì)數(shù)的樣品zui低稀釋度(如10-1,10-2,10-3等)

10.4.2 如接種所有(3個(gè))稀釋樣品的平板上，紫色(或紅色)菌落數(shù)均少于15個(gè)時(shí)，仍按式(1)計(jì)算，但應(yīng)在所得結(jié)果旁加“‘"號(hào)，表示為估計(jì)值。

10.4.3 如接種未稀釋樣品和所有稀釋樣品的平板上，紫色(或紅色)菌落數(shù)均少于15個(gè)時(shí)，報(bào)告結(jié)果為:每毫升(克)樣品少于15個(gè)大腸菌群。

10.4.4 如接種未稀釋樣品和所有稀釋樣品的平板上，均未發(fā)現(xiàn)紫色(或紅色)菌落數(shù)時(shí)，報(bào)告結(jié)果為:每毫升(克)樣品少于1個(gè)大腸菌群。

10.4.5 如平板上的紫色(或紅色)菌落數(shù)高于15個(gè)時(shí)，按式(1)計(jì)算，在結(jié)果旁加“，"號(hào)表示估計(jì)值或視情況重新選擇較高的稀釋倍數(shù)進(jìn)行測(cè)定。