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谷胱甘肽S轉移酶（GST）是一個含有211個氨基酸的蛋白，通常將該蛋白加入到重組蛋白的末端以便對該重組蛋白進行純化或檢測。具有組氨酸的非融合蛋白會產生非特異性結合，這會阻礙組氨酸標簽的親和純化。但GST標簽則與之不同。由于GST對于其底物-谷胱甘肽具有*的特異性，所以可以獲得更高的純度。

 

   另外，GST標簽蛋白含有特殊的剪切序列，純化后使用不同的蛋白酶即可簡單的去掉GST標簽。同時，GST標簽蛋白的純化在非常溫和的條件下進行，可有效保護靶蛋白的功能和抗原性。

 

   但是，在GST融合蛋白純化中，經常會遇到一些問題。本專題對這些問題進行了匯總，指出了大多數純化方法存在的普遍問題，對于特別的純化方法的問題也有提，形成了GST融合蛋白純化常見問題指南。

 

問題一：目的蛋白與磁珠不結合或結合效率低

 

可能原因：目的蛋白與磁珠不結合或結合效率低

 

解決辦法：測序確認，調整閱讀框以獲得GST.Tag融合表達蛋白；使用蛋白酶缺陷型大腸桿菌作為表達宿主菌；如果有稀有密碼子應采用Rosetta系列宿主菌。

 

可能原因：GST 融合蛋白被機械裂解的方法變性（比如超聲）

 

解決辦法：過度超聲會破壞標簽蛋白而減少其與磁珠的結合；在裂解過程中，用溫和的機械/化學裂解條件，裂解的條件必須依照經驗來決定。

 

可能原因：GST 融合蛋白在樣品中有聚集，導致沉淀

 

解決辦法：在細胞裂解前加入DTT，在緩沖液中也加入DTT 。1-20mM的DTT 會顯著增加某些GST融合蛋白的結合。

 

可能原因：GST融合蛋白的濃度過低

 

解決辦法：濃縮樣品。結合能力具有濃度依賴性。低表達量的蛋白可能不會像高表達量蛋白那樣有效地結合磁珠。因此，濃縮樣品會提高結合。

 

可能原因：標簽蛋白可能改變了GST 的構象，因此降低了GST 標簽蛋白的結合能力。

 

解決辦法：檢測所使用的pGEX 載體中GST的結合。準備帶有所使用的pGEX的細胞超聲裂解物，檢測其與磁珠的結合。如果結合的很好，則可能是標簽蛋白改變了GST 的構象，因此降低了GST 標簽蛋白的親和力。可以通過降低結合的溫度到4°C限制洗滌來改善結果。

 

可能原因：結合條件不佳

 

解決辦法：低于pH6.5或高于pH8時，融合蛋白與磁珠結合不充分導致結合效率低，請確認磁珠在用于目的蛋白純化前經過pH6.5~8.0緩沖液充分的平衡。

 

可能原因：磁珠使用次數過多

 

解決辦法：如果已使用幾次，應考慮磁珠再生或使用新的磁珠。

 

問題二：目的蛋白不能洗脫或洗脫效率低

 

可能原因：洗脫緩沖液的體積太少

 

解決辦法：增加洗脫緩沖液的體積。

 

可能原因：洗脫的時間不夠

 

解決辦法：增加洗脫緩沖液與磁珠反應的時間。

 

可能原因：洗脫緩沖液中谷胱甘肽濃度太低

 

解決辦法：增加洗脫緩沖液中谷胱甘肽的濃度：本方案中建議的10mM 濃度對于大多數應用來說足夠了，但是也存在例外。嘗試使用50mM Tris-HCl，20-40mM 還原型谷胱甘肽，pH8.0 作為洗脫緩沖液。

 

可能原因：洗脫緩沖液的pH過低

 

解決辦法：增加洗脫緩沖液的pH值：將pH增加到8-9 會增強洗脫而不用提高洗脫所用谷胱甘肽的濃度。

 

可能原因：洗脫緩沖液的離子強度過低

 

解決辦法：增加洗脫緩沖液中的離子強度，在洗脫緩沖液中加入0.1~0.2M的氯化鈉也會改善洗脫效果。

 

可能原因：洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了

 

解決辦法：使用新鮮配制的洗脫緩沖液。

 

問題三：洗脫的蛋白中有雜質

 

可能原因：GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

 

解決辦法：加入蛋白酶抑制劑。出現多條帶可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的結果。可在裂解溶液中加入1mM PMSF防止目的蛋白降解。一種無毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF，Roche Biochemicals的商品名為Pefabloc SC 。注：絲氨酸蛋白酶抑制劑必須在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

 

可能原因：在宿主細菌中的蛋白降解

 

解決辦法：多條帶可能是在宿主細菌中蛋白酶切造成的。如果是這種情況，需要使用蛋白酶缺陷型菌株（比如lon-或ompT），大腸桿菌BL21 隨pGEX 載體提供，這種菌株是ompT和lon缺陷型菌株。

 

可能原因：細胞破碎時超聲處理過度

 

解決辦法：降低裂解時間，機械裂解前加入溶菌酶（0.1 倍體積的10 毫克/毫升溶菌酶溶液，溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 ）可能會使結果變好。避免發泡，因為這可能使標簽蛋白變性。過分裂解也會導致宿主細胞蛋白和GST 標簽蛋白共純化。

 

可能原因：分子伴侶可能被共純化了

 

解決辦法：多余的條帶可能由于共純化一些分子伴侶所造成。這些分子伴侶參與大腸桿菌中新生成的蛋白的正確折疊。如：DnaK（分子量70 000）、DnaJ（分子量37 000）、GrpE（分子量40 000）GroEL （分子量57 000）、GroES（分子量10 000 ）。一些從這些共純化的蛋白中分離GST融合蛋白的方法已經發表。

 

問題四：目的蛋白酶切后電泳檢測發現多條條帶

 

可能原因：蛋白酶切發生在宿主細菌內

 

解決辦法：檢測條帶何時出現：如果確定多余的條帶在Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa切割前不存在，這些條帶可能是在宿主細菌中被降解的結果。目的蛋白可能含有Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa 的切割位點，請檢查序列。