制藥網(wǎng)
技術(shù)文章
雞痘病毒
發(fā)布時(shí)間：2010-2-26禽痘病毒屬 （Auipoxuirus）
禽痘病毒是感染禽類的病毒，種間具有交叉血清學(xué)反應(yīng)。通常不感染人與其它哺乳動(dòng)物。禽 痘病毒，特別是雞痘病毒是主要的病原體，使養(yǎng)雞業(yè)遭受重大損失。 病毒粒子內(nèi)含有大量脂質(zhì)，但對(duì)乙醚有抵抗力。禽痘病毒于感染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生A型包涵體。 禽痘可由吸血昆蟲機(jī)械傳播。 本屬包括雞痘病毒、鴿痘病毒、金絲雀痘病毒、燕八哥痘病毒和火雞痘病毒等。是 其代表種。
（一） （Fowlpox virus）
同義名：禽痘病毒，傳染性上皮瘤病毒，雞白喉病毒。主要侵害雞，引起皮膚型痘和粘膜型病變，后者即所謂的雞白喉。 各種年齡和品種的雞都易感，但雛雞的敏感性zui高。 18世紀(jì)以前，雞痘一直是養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一。世界上許多養(yǎng)禽地區(qū)幾乎都曾流行過 本病。我國農(nóng)區(qū)亦常見有本病發(fā)生，但因普遍采用疫苗接種措施，雞痘的發(fā)生率已經(jīng)明 顯下降。 雞痘多發(fā)于秋冬和早春。 除雞外，野雞（雉）和火雞也可感染，鴿也有時(shí)發(fā)生。鴨和鵝等水禽很少發(fā)生，即使感染，也 無嚴(yán)重癥狀。
〖BT4〗 1、形態(tài)和理化學(xué)特性 病毒粒子即原生小體，又稱Borrel小體，大小為280×330nm，表面呈現(xiàn)桑椹樣。于超 薄切片中，病毒中心為電子密度高的核心，即類核體。核心對(duì)胃蛋白酶有抵抗力，呈 現(xiàn) 兩面凹盤狀，由折疊或卷曲的管狀結(jié)構(gòu)組成，與假牛痘病毒的S狀結(jié)構(gòu)相似，側(cè)體分別位于 核心的兩個(gè)凹陷內(nèi)。核心和側(cè)體外面包圍有2～3層外膜（圖31-2）。 在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)包涵體中，可以看到大量的原生小體，故使包涵體呈現(xiàn)Feulgen陽性染 色。〖HT5”SS〗〖JZ〗圖31-2 〖WB〗電鏡照片〖DW〗——自李成等 〖HT5SS〗 病毒粒子核心中含有雙股線狀DNA基因組長約300kb,G+C=35%。DNA不具有感染性。D NA末端，同痘苗病毒一樣，具有單鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由于這一結(jié)構(gòu)的存在，原始基因組和末端 的酶切片段，經(jīng)堿和加熱變性后，很快可以復(fù)性。對(duì)痘病毒科內(nèi)不同屬中的一些成員進(jìn)行基 因組酶切圖譜分析，發(fā)現(xiàn)它們之間具有相似性，基因組中間部分的核苷酸序列比較保守 ，而基因組的兩端在長度和核苷酸序列上差異較大。一般認(rèn)為，基因組內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即保守 區(qū)的DNA序列，編碼病毒DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和增殖等一些重要酶類，兩端的側(cè)翼區(qū)與病毒的毒 力、宿主范圍相關(guān)，具有病毒種屬特異性。 類脂含量*，占其重量的1/3，其中約一半為角鯊烯。 現(xiàn)已分析出的28種多肽，分子量由10～135kDa不等。 Mishrq等（1994）應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)疫苗株（TVRJ）和兩株自然分離株進(jìn)行 蛋白質(zhì)分析，結(jié)果表明，三株病毒在75%～15%凝膠中電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分別產(chǎn)生45、 37 、39三條帶。免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)證明，大多數(shù)的蛋白質(zhì)多肽，具有免疫原性。但疫苗株與分離株 ，分離株與分離株之間在蛋白質(zhì)抗原性方面有所不同。 抵抗乙醚，對(duì)氯仿敏感，但曾報(bào)道某些毒株對(duì)乙醚的抵抗力不強(qiáng)，可耐1% 石炭酸和1∶1 000福爾馬林達(dá)9天之久。對(duì)干燥具有強(qiáng)大抵抗 力，痂皮內(nèi)的病毒可以 活存幾個(gè)月。但在雞糞和泥土中，活力通常不超過幾周。60℃和50℃加熱，分別可在10分 鐘 和30分鐘內(nèi)使其滅活。對(duì)于已由包涵體中脫出的病毒粒子，1%～2%苛性鉀或苛性鈉呈現(xiàn)明顯 的滅活作用。 冷凍干燥和50%甘油鹽水可使長期保持活力達(dá)幾年之久。
〖BT4〗2.培養(yǎng) 電鏡觀察雞胚絨毛尿囊膜上的感染，可見病毒在感染后2小時(shí)內(nèi)即被絨毛尿囊膜的 外胚 層細(xì)胞吞飲。經(jīng)48小時(shí)的潛伏期，于胞漿內(nèi)散在的“工廠區(qū)”內(nèi)出現(xiàn)未成熟的病毒粒子。 病毒粒子由雙層膜圍繞，中心為類核體。感染72小時(shí)后，胞漿中出現(xiàn)由許多層緊密編織的中 心性膜組成的髓鞘結(jié)構(gòu)，又稱微管結(jié)構(gòu)。于感染后96小時(shí)出現(xiàn)包涵體，包涵體內(nèi)含有成熟的 病毒粒子。約于感染后120～140小時(shí)，病毒粒子脫離包涵體，移向胞膜，并從細(xì)胞表面出芽 ，又獲得一層厚厚的外膜。 易在雞胚絨毛尿囊膜上生長，并可于3天內(nèi)產(chǎn)生白色隆起的大型痘斑。痘斑中心隨 后壞死，色澤變深。 易在組織培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞內(nèi)增殖，產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，并可在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi) 看到包涵體。
〖BT4〗3.血凝性 具有血凝性。細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的病毒增殖可用血細(xì)胞吸附試驗(yàn)測出。
〖BT4〗4.病原性 皮膚型雞痘潛伏期為4～8天。病毒侵入皮膚后，由于病毒增殖，上皮細(xì)胞增殖而在雞冠、肉 髯以及口角、 鼻孔和眼周圍的皮膚上出現(xiàn)增殖性病變——紅色突起的圓斑，繼則變?yōu)樯掀ち觯睆郊s5～6 毫米。這些病變?cè)谟|摸時(shí)有堅(jiān)硬感，呈現(xiàn)灰黃色。1～2天后，痘上皮瘤由痂皮被覆。在* 批痘病變附近又發(fā)生新的痘疹，結(jié)果在冠和肉髯表面形成一大片的痂皮。痘病變也可能出 現(xiàn)于眼結(jié)膜、角膜以及體軀其它部位的皮膚上。痂皮脫落部形成瘢痕，有時(shí)成為久不愈合的 潰瘍。病程約3～4周。病雞消瘦，產(chǎn)蛋停止，常需1～2個(gè)月才能恢復(fù)。 除上述的皮膚型雞痘外，還常見到白喉型雞痘。先在口腔和咽喉部粘膜表面出現(xiàn)黃白色稍 突起的小結(jié)節(jié)，隨后增大融合而成一層黃白色干酪樣假膜，覆蓋于粘膜表面。撕去假膜， 則露出紅色的出血性潰瘍面。假膜擴(kuò)大和增厚，可能阻塞口腔和咽喉，導(dǎo)致呼吸和吞咽困難 ，病雞發(fā)出咯咯聲。白喉型的死亡率較高，有時(shí)達(dá)30%～50%。 取病變部作組織學(xué)檢查，感染上皮細(xì)胞呈典型的空泡化或發(fā)生水腫樣變性，胞漿內(nèi)有大型 的嗜伊紅性包涵體。Allwright等（1994）報(bào)道有2群駝鳥發(fā)生禽痘病毒感染，臨床癥狀 與雞痘相似，并從病變組織中分離出。將含病毒材料涂于劃破的冠、皮膚和粘膜 上時(shí)，幾乎可使各種鳥類發(fā)生實(shí)驗(yàn)感染，癥狀與自然病例相似。
〖BT4〗5.生態(tài)學(xué) 雞痘主要因與病雞發(fā)生直接接觸而感染。白喉型病雞的呼吸道滲出液中含有大量病毒，可因 污染飲水、飼料和用具等而發(fā)生間接感染。不能侵入未破損的皮膚和粘膜，所以一 般認(rèn)為，感染是經(jīng)皮膚或粘膜上的微小擦傷或剌傷而發(fā)生的，但病毒也可以經(jīng)毛囊侵入。吸 血昆蟲，包括蚊、蠅、蜱、虱等呈現(xiàn)一定的病毒傳播作用。野鳥及鴨、鵝等動(dòng)物在傳播疾 病中的作用尚待證實(shí)。
〖BT4〗6.免疫 康復(fù)雞具有終生免疫力。人工免疫預(yù)防也有良好效果。當(dāng)前應(yīng)用的疫苗有鵪鶉化弱毒疫苗 、雞胚化弱毒疫苗、組織培養(yǎng)弱毒疫苗和鴿痘疫苗等。 鵪鶉化弱毒疫苗：是將連續(xù)通過鵪鶉胚致弱而育成的弱毒株。制苗時(shí)，將弱毒株接 種11～12日齡雞胚絨毛尿囊膜。4～5天后收獲水腫、增厚或有痘斑的絨毛尿囊膜，制成凍干 苗 或甘油苗。應(yīng)用時(shí)剌種于雞的翅膀內(nèi)側(cè)無血管處皮下，每只雞剌種一次。接種后約一周，局 部出現(xiàn)綠豆大痘皰，以后逐漸結(jié)痂。這種疫苗比較安全，免疫期約5個(gè)月。也可用于火雞。 雞胚化弱毒疫苗：是將連續(xù)通過雞胚致弱而育成的弱毒株。這種疫苗的免疫原性較 好，免疫期6個(gè)月以上，但對(duì)幼雞常有較高毒力。組織培養(yǎng)弱毒疫苗：是將連續(xù) 通 過細(xì)胞培養(yǎng)物減毒而育成的弱毒株，例如通過200～400代的HP1細(xì)胞培養(yǎng)，可供飲水免 疫，可用于5日齡雛雞，安全有效。但需在3～4周后作第二次免疫。也有將火適應(yīng) 豬腎細(xì)胞培養(yǎng)物40代而育成的弱毒株。 鴿痘疫苗：是一種異型疫苗，即用鴿痘病毒給雞接種。制苗時(shí)將鴿痘病毒接種雞胚絨毛尿囊 膜、雞胚細(xì)胞和鴨胚細(xì)胞培養(yǎng)物。這種疫苗比較安全，免疫期約6個(gè)月，也可用于火雞和鴿 。上述雞痘疫苗已被成功地與新城疫和/或馬立克疫苗聯(lián)合應(yīng)用，但需用非腸道接種 途徑。 隨著對(duì)等禽痘病毒分子生物學(xué)研究的逐步深入，近些年來，研究開發(fā)禽痘病毒，尤 其是作為一種新的病毒載體，研究制備禽類基因工程重組疫苗或哺乳動(dòng)物的非 復(fù)制型重組病毒疫苗，日益受到研究者的重視。已有多種病毒的保護(hù)性抗原基因，得到表達(dá) ，如禽流感病毒HA基因、雞新城疫病毒的F、HN基因、馬立克氏病毒的PP38基因等。在美國 應(yīng)用為載體，研制的新城疫重組疫苗，已進(jìn)入免疫試驗(yàn)階段。
〖BT4〗7.診斷 根據(jù)臨床癥狀和發(fā)病情況，常可作出正確診斷。應(yīng)用組織學(xué)方法尋找感染上皮細(xì)胞內(nèi)的大型 嗜酸性包涵體和原生小體，也有較大診斷意義。剪取痘病變組織，用切面在玻片上涂成涂 片后，用Mopoeov或Fontana法染色，極易見到單在、短鏈和成堆的原生小體。 （1）病毒的檢出和分離： 應(yīng)用滅菌的剪刀切取痘病變部，深達(dá)上皮組織，以新形成的痘疹。將其制成超薄 切片后作電鏡檢查，直接檢查病毒粒子，或者用乳缽或組織研磨器研磨并低速離心后取其上 清液作負(fù)染后電鏡檢查。 分離病毒時(shí)，將痘病變組織置于滅菌乳缽內(nèi)，加入石英砂后充分研磨，并加入Hanks液、生 理鹽 水或肉湯（每毫升含青、鏈霉素1 000單位或1 000微克），作成10%乳劑。室溫感作1～2小時(shí) 后低 速離心沉淀，吸取上清作接種用。如為白喉型病變，則可撕取口腔或咽喉部的假膜，如上方 法制備乳劑。隨后用其接種雞胚、幼雞、雞胚細(xì)胞或雞胚腎細(xì)胞。 ①雞胚接種：選用9～12日齡雞胚，接種01毫升病料乳劑于絨毛尿囊膜上。接種后將雞胚 置3 7℃繼續(xù)孵育5～7天，檢查絨毛尿囊膜上是否出現(xiàn)白色灶狀痘斑。初代接種有時(shí)不出 現(xiàn)典型病變，可取接種部絨毛尿囊膜作組織學(xué)或電鏡檢查，或?qū)⑵淠ニ楹笞鞒扇閯^ 續(xù)傳代適應(yīng)。②幼雞接種：用細(xì)針將雞冠輕輕劃破，隨后涂抹上述乳劑。易感雞在接種5 ～10天后于接種部產(chǎn)生病變，并常擴(kuò)散至冠和身體的其它部位。 ③細(xì)胞培養(yǎng)物接種：易在原代雞胚細(xì)胞和雞胚皮膚細(xì)胞內(nèi)增殖，并在接種后2～6天 內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞病變——細(xì)胞變圓，折光性增強(qiáng)，隨后變性破壞。在接種后48小時(shí)出現(xiàn)胞漿內(nèi)包 涵體。 分離獲得病毒以后，即可根據(jù)上述的形態(tài)和理化學(xué)特性加以鑒定。 （2）血清學(xué)鑒定： 取自然或人工感染后1～2周的病雞血清作為免疫血清。將痘疹、痘皰、白喉型假膜或感染的 絨 毛尿囊膜作成乳劑后與抗雞痘免疫血清作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，常可在24～48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)1～2條（ 有時(shí)多 達(dá)5條）沉淀線。瓊脂凝膠由1%瓊脂、8%NaCl和001%硫柳汞配制而成。如將上述病料 乳劑先作超聲波處理，隨后加入1/2量的氟碳（Genetron 113），勻漿化后，離心沉淀，吸取 上層水相。再加1/2量的碳氟重復(fù)如上處理，用其上層水相作抗原，可以明顯提高陽性檢出 率。 這種初步提純抗原也可用于包被醛化紅細(xì)胞，作間接血凝試驗(yàn)，用以檢測抗體。抗體出現(xiàn)于 感染后1周，持續(xù)約15周。 以提純的蛋白（10mg/ml）包被反應(yīng)板，檢疫免疫接種或自然感染雞的血清抗體，具 有較高敏感性和特異性，可用于實(shí)際免疫監(jiān)測。 如作中和試驗(yàn)，可于病料乳劑中加入免疫血清，感作后接種雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)物。 應(yīng)用熒光抗體或酶標(biāo)抗體檢測涂片或切片中的病毒粒子或病毒抗原，也可獲得較好結(jié)果。