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氯化鈣法進?質體的轉形
發布時間：2010-7-5用冰?的CaCl2 制備competent cells，以傳統方法進?質體的轉形。
儀器用具：37℃培養箱；42℃水浴；冰浴
藥品試劑：
0.1 M CaCl2置冰浴中
2 M glucose：
取18 g glucose溶于水中，并調體積至50 mL，無菌過濾，分裝后置 -20℃貯存。
2 M Mg2+：
取20.3 g MgCl2 · 6H2O及24.65 g MgSO4 · 7H2O溶于水中，并調體積至100mL，無菌過濾的，分裝小瓶置 -20℃貯存。亦可以MgCl2*取代MgSO4。
SOB 液體培養基：
32 Methods in Biotechnology Vol 1
2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl，高壓滅菌，使用前加入2 M Mg2+，使zui終濃?為10 mM。
SOB 固體培養基：
2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.5% Bactoagar，高壓滅菌，倒plate前加入2 M Mg2+ 使zui終濃?為10 mM。
SOC/Amp 固體培養基：
SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin。
SOC 液體培養基： SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）。
大腸桿菌菌株： JM109
#1~#5 接合反應液
方法步驟：
1） 進?轉形實驗前16~20 h，自 -70℃取出貯存的菌種，以劃單一菌?方式將菌株JM109 接種在SOB固體培養基上，在37℃培養。
2） 取40 mL SOB培養基裝入125 mL已滅過菌的三角瓶 （請記得加入Mg2+）。 另取1 mL SOB加于微?離心管中。 由SOB固體培養基上選4~6 個約2~3 mm大小的單一菌?接入1 mL SOB中，震蕩將菌體打散后，加入40 mL SOB中，于37℃震蕩培養約2~3 h，直至細胞數約為4~7×107/mL。 可于接菌2 h后每隔20~30 min測A600估計
3） 收集菌液于離心管中，置冰浴中10~15 min。
4） 以750~1,000 g 離心12~15 min （4℃）。
5） 倒去上清，并盡?將液體倒干，或以微?移液器頭吸干凈。
6） 沉淀加入1/3 菌液體積冰?的0.1 M CaCl2，稍加震蕩，混合均勻，置冰浴中10~15 min。
7） 同上4）, 5） 的操作。再重復6）, 4）, 5） 的操作，以使反應?*，增加成功?。
8） 加入1/25 菌液體積冰?的0.1 M CaCl2，稍加震蕩使混合均勻。
◆ Competent cells 制備完成！
9） DNA 樣品 （<10 μL） 先裝于微?離心管中，置冰浴中預?，另取一微?離心管，標上 #0，?加入任何DNA （作為negative control），亦置冰浴中預?。
每個樣品加入200 μL 菌液，震蕩混合后，置冰浴中20~40 min。
10） 42℃加熱90 s （溫?及時間均需很準確，請事先檢查水浴鍋的溫?，?可超過42℃）。
◆ Heat shock！
11） 置冰浴中2 min。
12） 加入800 μL SOC，混合后，于37℃震蕩培養30~60 min。
13） 將各管轉形液上下搖動混合均勻后。#5 取20 μL 至另一離心管中，加入180μL SOC （稀釋10 倍），混合均勻后，涂布于SOC/Amp plate。 #0, #1~#4 各取200 μL 涂抹在SOC/Amp plate。 剩余菌液以6,000 rpm 離心1 min，倒去上清，沉淀加入200 μL SOC，均勻打散后涂抹在另一個SOC/Amp plate 上。
14） 待培養基表面的菌液*被吸收后，倒置培養皿于37℃培養16~20 h 后，觀察各個plate 上菌?的形?并計算菌?數。