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熒光色素的熒光光譜和量子產率受環境影響，這也是眾多熒光素具有探針作用的基礎。影響因素主要有：

1）熒光色素染液的pH：熒光色素是否發射熒光以及輻射何種熒光與它們在溶液中的存在狀態有關。熒光色素均含有酸性或堿性助色團．溶液的酸堿性對它們的電離有影響，每種熒光色素有它zui適宜的pH。一些熒光色素在pH 8．5～9．5g寸，發射熒光較強，例如1-萘酚-6-磺酸在pH 6．4～7．4的溶液中會發射藍色熒光，當pH低于6．4時，則不發射熒光。

2）溫度：熒光色素的熒光量子產率和熒光強度通常隨溶液溫度的降低而增加，如熒光素的乙醇溶液在0℃度以下每降低10℃熒光量子產率增加3％，降至－80℃時，熒光量子產率接近100％；反之則減弱，甚至導致熒光淬滅。但一般在20℃以下熒光量子產率隨溫度變化不太明顯，故進行熒光染色過程中，要注意控制溫度。但有些熒光染色如熒光抗體染色，在37℃時，溫度對異硫氰酸熒光素的熒光效率無明顯影響。

3）溶劑性質對熒光素的影響：溶劑性質對熒光素的熒光強度有明顯影響，同種熒光素在不同溶劑中，其熒光光譜的位置和強度均有差別。熒光染色時常根據所需要的pH值緩沖液配制染液。

4）熒光素濃度的影響：熒光素濃度對熒光強度的影響更明顯。在稀溶液中，熒光強度與熒光素的濃度呈線性關系；濃度增加到一定程度時，熒光強度保持恒定，即使再增加濃度，熒光強度也不發生變化；若濃度繼續增加，超過一定限度后，由于熒光物質分子間的相互作用引起自身熒光淬滅現象，使熒光強度隨著濃度的增加而減弱。熒光素染色的應用濃度一般為10－3～10－5mol/L。

由此可見，在進行熒光探針實驗時，應注意合適的pH、溫度、溶劑和熒光素濃度等條件。另外，染色液新鮮配制，先配高濃度儲存液，臨用前再稀釋，避免因儲存時間過長而失效。