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分子蒸餾的工作原理基于分子運動平均自由程的差異。

在高真空環境下，分子之間的碰撞幾率大大降低。當液體混合物受熱后，輕分子的平均自由程大，能夠快速到達冷凝面并冷凝；而重分子的平均自由程小，難以到達冷凝面。

具體來說，混合物被加熱形成薄膜，在蒸發面迅速蒸發。由于輕分子的熱運動速度快，能夠在較短的距離內不受其他分子碰撞而直接到達冷凝面，被冷卻收集；重分子因運動速度較慢，在到達冷凝面之前就會與其他分子碰撞而返回蒸發面，從而實現了輕、重分子的分離。

例如，在分離魚油中的不飽和脂肪酸時，較輕的不飽和脂肪酸分子能夠更容易地到達冷凝面被收集，而較重的飽和脂肪酸分子則留在蒸發面，從而實現了有效分離。