聯系電話
齊一生物科技（上海）有限公司
初級會員·11年
- 聯系人：
- 程成
- 電話：
- 021-60348496
- 手機：
- 18121453965
- 傳真：
- 021-51632657
- 地址：
- 上海市松江加工園區
- 網址：
- www.qiyibio.com
掃一掃訪問手機商鋪
微信掃碼進入微名片
順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書
For Research Use Only
僅供研究用
貨號：QYS-233045
分光光度法 50 管/48 樣
順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義
順烏頭酸酶（aconitase），三羧酸循環中的酶，催化檸檬酸轉變為異檸檬酸。檸檬酸本身不易氧化，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應，使羥基由β碳原子轉移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進一步的氧化脫羧反應作準備。
測定原理
ACO 催化檸檬酸轉化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將 NAD+ 還原生成 NADH，導致 340nm 處光吸收上升。
順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書需自備的儀器和用品
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：50mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：10mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：1mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加 3mL 蒸餾水充分溶解；現配現用
試劑七：粉劑×1 支，4°保存；臨用前加 36mL 試劑四充分溶解；
工作液：臨用前在 36mL 試劑七中加入 3mL 蒸餾水、3mL 試劑四、3mL 試劑五、3mL 試劑六充分混勻
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器
或研缽勻漿。
2、將勻漿轉入離心管內 600g，4℃離心 5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
4、上清液即胞漿提取物，可用于測定胞質順烏頭酸酶活性。
5、在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），用于線粒體順烏頭酸酶活性測定。
測定步驟
1、分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。
2、樣本測定
（1）將工作液，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min；現配現用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存，一星期內可用。
（3）在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 樣本 900μL 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s
時的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，計算ΔA=A2-A1。
ACO 活性計算
順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書用石英比色皿測定的計算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活性單位。
ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T=536×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活性單位。
ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=108×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活性單位。
ACO 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.722×ΔA V 反總：反應體系總體積，0.001 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，3min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。
