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齊一生物-科研試劑供應商

2004 年，以色列特拉維夫大學（ Aviv University in Israel）的腫瘤學家 Gideon Rechavi 等人將當時能夠找到的所有人類基因組 DNA 序列與對應的 mRNA 進行了比對。他們希望找到 mRNA 序列里的腺嘌呤（adenosine, A）轉換成次黃嘌呤（inosine, I）的信號。這種 A 到 I 的轉換會改變蛋白質的編碼序列，對于我們人類而言，這是保證天然免疫系統正常功能的關鍵因素。據 Rechavi 回憶，這項工作聽起來簡單，但實際上非常復雜。好多個研究小組都曾作出嘗試，但結果都以失敗告終。這主要是因為當時的測序技術還不太發達，會產生很多錯誤的測序結果，比如單堿基突變結果，進而帶來了很大的數據噪聲。但是 Rechavi 等人使用了新的生物信息學工具，所以成功地在轉錄組中發現了數千個 A—I 轉換位點，而一個細胞，或者物種的所有 mRNA 其實也就這么多。后續的研究又陸續將這些 A—I 轉換位點的數量增加到了數百萬個。

發現次黃嘌呤轉換算得上是一種特例，因為科研人員只需將 DNA 序列與 RNA 序列進行比對，就能夠輕易地發現這些位點。但是在 mRNA 的序列里，至少有 1/4 的核酸（A、C、G、U）是攜帶有化學修飾物的（我們將 DNA 序列里的這種修飾稱作表觀遺傳學修飾），只不過現有的測序手段無法發現這些修飾物。科研人員也不知道這些修飾物會給 RNA 帶來怎樣的改變，因此他們正在努力解決這個問題。

近五年來，學界掀起了一股研究 RNA 表觀遺傳學修飾的熱潮，很多課題組都將目光集中在 N6 - 甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）這個核酸分子上。大家都在研究全轉錄組水平上的這種化學修飾，以及該修飾與人體健康和疾病的關系。但該研究面臨的問題也是非常大的，因為這種修飾不僅發生在 mRNA 分子上，同時也發生在其它 RNA 分子上，幾乎涉及到了生命科學的所有領域，連病毒的 RNA 都會發生這種修飾。

其實這些修飾本身并不新奇。我們現在之所以這么關注這種修飾的意義，這么關注所謂的表觀轉錄組學，是因為發現了與這些修飾有關的酶，并且對這些酶也有了一定的認識和理解。2010 年，美國芝加哥大學（University of Chicago, Illinois）的化學家 Chuan He 提出，這種化學修飾反應是可逆的，而且對于基因表達調控具有非常重要的作用和意義。不久之后，He 的課題組*個發現了 mRNA 化學修飾去除酶——FTO。該發現意味著 m6A 不只是一個被動的修飾物，細胞也可以逆轉這種修飾反應，即 mRNA 的化學修飾是可以由細胞來操控的。與此同時，隨著新一代測序技術的發展，我們將能更方便地開展全基因組范圍內的測序，也讓全轉錄組修飾（m6A 等）研究成為可能。

這就是一個甲基化修飾過的 RNA 分子，圖中淺藍色表示的就是 m6A。

今天，表觀轉錄組學研究正在蓬勃開展，不過相關的技術仍然不夠完善，還需要繼續開發。比如目前的技術在靈敏性（sensitivity）上就尚有不足，無法對少量的、稀有的樣本開展研究、無法對轉錄組修飾開展定量研究，并且無法通過一次試驗發現多種不同的修飾等。美國芝加哥大學（University of Chicago）的分子生物學家 Tao Pan 也參與了 He 等人發現 FTO 的工作，他認為現在zui需要的是能夠檢測所有 RNA 修飾物的技術。

不過這也說明，從事表觀轉錄組學研究的科研人員對于他們正在鉆研的這個領域還是非常熱衷的。美國紐約 Weill Cornell 醫學院（Weill Cornell Medical College in New York City）的遺傳學家 Chris Mason 曾經領導過 m6A 的作圖工作，她認為這就好像人們在想著 DNA 時，一定也在想著 DNA 的折疊過程，或者 DNA 的表觀遺傳學修飾過程。Mason 相信，現在，或者說在不久的將來，人們在想著 RNA 的時候，肯定也會同時想到它們的修飾過程。

早在上世紀七十年代初，科學家們就發現 mRNA 存在化學修飾的現象，當時使用的試驗技術是對 m6A 進行放射性標記。但是因為這些試驗都是通過 mRNA 3’端多聚腺嘌呤尾高選擇性技術來富集 mRNA 分子的，所以科研人員們擔心這會摻雜進其它種類的 RNA。據美國 Weill Cornell 醫學院的化學生物學家 Samie Jaffrey 介紹，正是因為這個原因，讓他們無法確定 mRNA 里是否還存在其它 RNA，以及是否發生了‘污染’，因此都放棄了這種試驗方案。

另一個難題就是確定 mRNA 里哪些位點發生了 m6A 修飾，這些信息能夠幫助我們了解這些基因的功能。傳統測序技術會用到逆轉錄反應，即將 RNA 逆轉錄成互補的 cDNA，然后再對 cDNA 進行擴增及測序。可是這些逆轉錄酶會去除 mRNA 上的修飾物。對此，Jaffrey 指出，所以我們根本看不到 m6A，只能看到‘未修飾的’A。

不過雖然存在這些技術上的障礙，我們還是在細菌的 RNA 上發現了一些修飾現象，這也引起了 Jaffrey 的興趣，她決定看看在哺乳動物的 RNA 里是否也存在這種修飾現象。

Jaffrey 和 Mason 一起，首先將 RNA 分子切成一個、一個的小片段，然后用含有特異性針對 m6A 的抗體對這些 RNA段進行洗脫，zui后對富集后含有 m6A 修飾物的 RNA 分子測序。據 Jaffrey 介紹，通過這種方法，她們清楚地看到了 mRNA 上的修飾物，而且*沒有其它 RNA 的污染。Rechavi 的課題組也通過類似的方法發現了大量的 m6A 修飾位點，他們在人類 7000 多個基因里一共發現了將近 12000 個 m6A 修飾位點。這些位點主要都位于蛋白質編碼區（外顯子）內，或者終止密碼子內。

目前，這些名為 m6A-seq 和 MeRIP-seq 的研究方法已經被人們廣泛采用，以用于對各種疾病或器官的 m6A 開展相關研究。目前，人們可以很方便地獲得特異性識別 m6A 的抗體和試劑，比如 Active Motif (go.nature.com/2kqgzu8)、MilliporeSigma (go.nature.com/2kw39m3) 和 New England BioLabs (go.nature.com/2kqjjaz) 等公司都提供這類科研試劑。科研人員們相信，這些 RNA 修飾會參與細胞分化過程的調控，而該過程出現錯誤就會導致腫瘤，因此 RNA 修飾很可能與腫瘤有關。實際上，我們也已經發現了表觀轉錄組與腫瘤之間的。比如 He 等人就發現，某些急性粒細胞白血病（acute myeloid leukaemia）的病人，體內 FTO 的含量就明顯高于正常水平，因此很多 m6A 位點都被去修飾了，這就有可能促使細胞發生分化。

但是 Jaffrey 等人做的另外一個同樣的研究則獲得了*相反的結果。該研究使用的是 miCLIP 技術，該技術的分辨率更高。結果發現，m6A 抗體也能夠與另外一種化學修飾物——N6，2 - 氧 - 二甲基腺苷（N6, 2?-O-dimethyladenosine, m6Am）結合。M6Am 主要見于 mRNA 5’帽子結構處。不過 Jaffrey 當時并不清楚這種修飾有什么具體的生物學意義。現在他們已經知道，m6Am 才是 FTO 的作用靶點，而不是 m6A。M6Am 會影響 mRNA 的穩定性，及其在細胞內的定位。再結合上 He 之前的研究成果，這提示我們，m6Am 與急性粒細胞白血病的發病和發展有關。

美國斯坦福大學（Stanford University, California）的腫瘤生物學家 Howard Chang 認為，這些現象都是一個新興研究領域里非常常見的，這與組蛋白修飾研究領域早期的發展狀況（當時的矛盾情況更加突出）還不太一樣。

腫瘤生物學家 Howard Chang

其它 RNA 化學修飾也引起了科研人員的注意。2016 年，由中國北京大學（Peking University）的化學家 Chengqi Yi 和 Rechavi 與 He 共同領導的兩個課題小組使用抗體技術，對小鼠和人的細胞系，以及組織進行了 N1 - 甲基腺苷（N1-methyladenosine, m1A，早在上世紀 60 年代初就已經發現了這種化學修飾物）的作圖研究。他們使用了多種不同的方法，來防止逆轉錄反應干擾 RNA 中的 m1A。他們都發現，m1A 位于 mRNA 的翻譯起始位置。應激條件會改變 m1A 的位置，這也說明這種化學修飾是一個動態調控的過程。

雖然科研人員們還不太清楚 m1A 的具體作用，但是他們已經找到了一條比較有意思的線索，即絕大多數 RNA 都只含有一個 m1A 位點，而且這些被修飾過的位點的翻譯頻率要遠遠高于其它未修飾的位點。據 Rechavi 介紹，這一點讓他們非常興奮，當然也是一個挑戰，因為他們即將面對的是一套全新的 mRNA 翻譯調控機制。目前，人們可以在 MBL International (go.nature.com/2kvqpfs) 等地購買到特異性識別 m1A 的抗體。

其它全轉錄組化學修飾研究策略主要利用的就是某些 RNA 修飾物能夠與其它化學標簽結合的特性。Yi 在 2011 年末建立自己的實驗室時，大家已經非常清楚，在其它 RNA 里含有很多修飾過的 RNA 組成核酸——假尿嘧啶（pseudouridines，pseudoUs），但是在 mRNA 里還沒有發現過這些核苷。2015 年，Yi 的實驗室發現了一種化學標記和洗脫方法，可用于富集 mRNA 上的化學修飾物。出乎預料的是，他們在人和小鼠的 mRNA 中，發現了大量的假尿嘧啶，遠遠超出了預期。于是他們開始專注于研究這些化學修飾物的功能。Yi 等人認為，mRNA 里的假尿嘧啶可能具有多重功能，這取決于它們在什么時候、什么位置、如何出現，以及是如何對 RNA 進行調控的。目前人們也發現了很多假尿嘧啶寫入因子，但是還不清楚是否存在假尿嘧啶擦除因子和識別因子。

不論是使用抗體還是化學標記的方法，發現 RNA 中化學修飾的位置都是一項非常麻煩的工作。比如，使用抗體時會面臨交叉反應的問題，因此，科研人員必須使用 2 種以上的抗體進行實驗，而且還得進行交叉驗證。而使用化學標記方法又有可能更傾向于切斷、并結合和富集某些特定的 RNA段，而帶來偏倚。據 Yi 介紹，測序深度和所使用的生物信息學軟件也會影響影響我們發現 RNA 修飾位點的工作。此外，細胞培養時間也會影響 RNA 的修飾水平。鑒于此，Mason 認為，獲得一個基準的參考圖譜非常重要。

但是在任何時候，僅僅只知道某個 RNA 分子上有哪一種化學修飾是遠遠不夠的。我們還需要對所有的 RNA 修飾進行定量分析，這也是非常重要的工作。Pan 指出，因為細胞也許就是依靠一定量的 RNA 修飾，才能夠行駛某種功能。對于那些希望通過激活 RNA 修飾相關蛋白來調控 RNA 修飾水平的科研人員而言，這種修飾定量信息尤為重要。據 Pan 介紹，我們已經發現了這些 RNA 修飾相關蛋白，這提示細胞對 RNA 修飾進行精密調控的重要性。

2015 年，Pan 的課題組提出了關于 RNA 修飾水平的定量研究策略，至少可用于 tRNA 的修飾研究工作。該策略采用了一種特殊的逆轉錄酶，能夠以較高的效率通讀待測 RNA 分子，哪怕 RNA 分子中有很多位點已經發生了化學修飾，也不影響該逆轉錄酶的效率。這樣一來，他們就可以獲得全長 RNA 序列了。Pan 的課題組就正在用這種策略研究 mRNA 的 m1A 修飾問題。

但是，可能zui快速了解這些化學修飾物功能的方法就是發現它們的識別因子（readers）、寫入因子（writers）和擦除因子（erasers）。2012 年，他們在做 m6A 研究時就創造了用已修飾和未修飾的短 RNA段的富集方法。當時他們使用這些短 RNA段做 “誘餌”，來釣取與這些 RNA 相結合的蛋白因子。2014 年，他們課題組又使用類似的策略發現了好幾個 m6A 識別因子。其他的研究也發現了這些 RNA 的其它細胞內作用。現在，Rechavi 準備嘗試用這種“釣魚” 策略來研究 m1A。不過由于 m1A 的位置更加集中于翻譯起始位點，該處的分子結構更加緊密，所以實驗難度可能會更大。

一旦我們發現了能夠識別某種化學修飾物的因子，那么就可以很容易地通過基因編輯技術來調控該因子的表達，從而幫助科研人員從全局的角度去發現化學修飾改變的跡象。比如，Chang 就通過去除某個 m6A 修飾酶的方法，證明了該修飾作用對于細胞的命運具有決定性的意義。

但是隨著表觀遺傳學涉及的范圍越來越廣，從 DNA 擴展到 RNA，如何認識和理解這些核酸上的化學修飾的功能變成了一個大難題，比如同一個酶可能會作用于好多種不同的 RNA，同一種化學修飾在不同的 RNA 上也可能會發揮不同的功能。Chang 表示，如果有一天我們發現，有一些功能是通過其它我們還沒有發現的 RNA 來行使的，他一點都不會覺得奇怪。

這是一幅 DNA 分子上結合了 RNA 聚合酶的復合體的電鏡照片。

近幾年，He 的課題組又發現，RNA 修飾是一種轉錄子調控機制，它參與了細胞內多種不同的作用，比如啟動細胞分化程序等。因此，科研人員們迫切需要更多、更好的新技術，來探索這方面的奧秘。去年 10 月，美國國立衛生研究院（NIH）給 He 和 Pan 提供了一個為期五年，總金額為 1060 萬美元的資助，以幫助他們建立一個新中心，用于開發與 RNA 修飾研究有關的新技術。其中有一項任務就是找到一種在修飾位點引入突變，并且大量擴增這些突變的方法。

由于有了新的影像學技術，所以我們有可能在肉眼直視（visual inspection）下看到某個 RNA 分子上的修飾物。據 He 介紹，他非常想向大家介紹，已經有人開發出了能夠直接對 mRNA 分子上的 m6A 修飾物進行成像的技術。不過當時的情況還不是那樣的。Ye Fu 之前曾經在哈佛大學（Harvard University in Cambridge, Massachusetts）的生物物理學家莊小威的實驗室里做博士后研究，他現在就正在開發這項技術。Fu 的策略是將超高分辨率的顯微鏡與莊小威之前開發的一個單細胞內 RNA 可視技術——多重抗誤差矯正熒光原位雜交技術（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization, MERFISH）結合起來。Fu 表示，他近兩年已經取得了一定的進展，但目前的問題是數據噪聲太大，所以還需要進一步優化，使檢測的效率更高。

其它方面的工作還包括開發新的 RNA 直接測序技術，以替代傳統的 RNA 測序方法。比如英國牛津納米孔技術公司（Oxford Nanopore Technologies in the United Kingdom）的科研人員就曾經報道他們已經成功地將 DNA 納米孔測序技術拓展成 RNA 納米孔測序技術。美國加利福尼亞州門羅公園的太平洋生物科技公司（Pacific Biosciences in Menlo Park, California）也成功地利用自己的單分子實時測序技術（single-molecule real-time，SMRT）直接對 RNA 進行了測序。據該公司的科學官 Jonas Korlach 介紹，其實這個 RNA 測序技術的想法是和他們的 SMRT 測序技術同時誕生的。所謂 SMRT 測序技術，就是使用 DNA 聚合酶來擴增 DNA 分子，在熒光標記的核酸摻入新合成的 DNA 鏈時，同時檢測熒光信號，完成測序工作。為了讓這項技術也能應用于 RNA 測序工作，Korlach 和 Mason 等人將 DNA 聚合酶替換成了源自 HIV 的逆轉錄酶。隨后還是利用 DNA 測序平臺進行測序，由于當逆轉錄酶通過 RNA 鏈中發生了化學修飾的核酸位點時，逆轉錄速度會明顯放慢，因此會產生一個很明顯的反應動力學信號，借助這個信號就能夠很方便地知道，哪個位點發生了化學修飾。

由于 RNA 與 DNA 存于差別，所以科研人員們碰上了很多以前在 DNA 測序時沒遇到過的困難。比如 RNA 分子自身非常容易發生折疊，形成各種環狀結構（loop）和結狀結構（knot）。所以英國牛津納米孔公司的方法就是讓 RNA 與一個 cDNA 結合在一起，以消除 RNA 的二級結構，從而可以通過納米孔通道。再比如，RNA 非常容易降解，所以在待測 RNA 鏈非常長的時候，也會帶來不小的麻煩。

數據方面也有不小的困難，比如 RNA 修飾的數量就是個問題。在一個 RNA 分子上找出所有的修飾，這需要對軟件進行大量的、嚴格的訓練，才能夠讓它們準確地識別并區分每一個修飾位點的具體情況。美國約翰霍普金斯大學（Johns Hopkins University in Baltimore, Maryland）的生物醫學工程師 Winston Timp 就曾經利用英國牛津納米孔公司的技術，自己開發了一個檢測 DNA 修飾信息的技術。他現在也準備轉戰 RNA 修飾領域，打算開發一個能夠識別 m6A 的軟件。據他介紹，問題在于，他們并不清楚一個 RNA 分子上有多少個不同的修飾情況。但是有一點他們很清楚，這個領域非常有意思，值得繼續深究下去。