引 言
生牛乳中富含多種天然活性蛋白，如 α-乳白蛋白 (α-Lactalbumin)、β-乳球蛋白 (β-Lactoglobulin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin, LF)、免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 和乳過(guò)氧化物酶 (Lactoperoxidase, LP) 等，這些天然活性蛋白在抵抗細(xì)菌、病毒入侵，增強(qiáng)免疫力，促進(jìn)組織修復(fù)和生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用。其中乳鐵蛋白能夠參與機(jī)體鐵代謝，促進(jìn)體內(nèi)鐵元素的吸收和運(yùn)輸，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力的功能。不同的熱處理方式(巴氏殺菌、超高溫 (UHT) 滅菌、蒸發(fā)濃縮及噴霧干燥等)，會(huì)導(dǎo)致乳制品中乳鐵蛋白出現(xiàn)不同程度的變性失活，從而影響其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及市場(chǎng)售價(jià)。
賽默飛新國(guó)標(biāo)應(yīng)對(duì)方案亮點(diǎn)
1.本試驗(yàn)參考 GB 5009.299-2024、NY/T 4439-2023 以及相關(guān)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳和嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定。
2.為獲得良好的峰形和分離度，試驗(yàn)對(duì)樣品前處理和液相色譜條件進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，在柱溫 30 ℃、流速 1.0 mL/min 條件下，以 0.1% 三氟乙酸水-0.1% 三氟乙酸乙腈 作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，系統(tǒng)最大壓力值不超過(guò) 106 bar。
3.試驗(yàn)結(jié)果表明：乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (50.0 μg/mL) 色譜峰不對(duì)稱因子 1.00，峰形良好，理論塔板數(shù) 30549，柱效優(yōu)異；連續(xù)三次進(jìn)樣，保留時(shí)間和峰面積的 RSD 均小于 1%，方法重現(xiàn)性好；線性低點(diǎn) (1.00 μg/mL) 信噪比為 8.2，方法靈敏度較高；線性范圍 1.00-200 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù) r2≥0.9998，線性良好。
4.在反相液相色譜法測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白含量的試驗(yàn)中，BioBasic 4 色譜柱(孔徑 300 Å)配合 Vanquish Core 高效液相色譜系統(tǒng)，表現(xiàn)出了良好的重現(xiàn)性和優(yōu)異的穩(wěn)定性，方法檢出限和定量限均滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，可供乳制品企業(yè)及食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室參考。
GB 5009.299-2024
賽默飛完整應(yīng)用解決方案
01
樣品前處理
1.1 試樣提取
1.1.1 液體試樣：低溫奶(生牛乳、巴氏殺菌乳)/ 常溫奶(超高溫 (UHT) 滅菌乳)
稱取試樣 5 g(精確到 0.1 mg)于 50 mL 帶刻度旋蓋離心管中，用磷酸鹽緩沖液Ⅱ定容至 25.0 mL，渦旋振蕩提取 3 min，12000 rpm 4 ℃ 離心 15 min。室溫靜置，去除上層浮脂，取上清液待凈化。
1.1.2 固體試樣：乳粉(嬰幼兒配方奶粉)
稱取試樣 2 g(精確到 0.1 mg)于 50 mL 帶刻度旋蓋離心管中，加適量磷酸鹽緩沖液Ⅱ溫?zé)嵴駬u溶解，用磷酸鹽緩沖液Ⅱ定容至 50.0 mL，渦旋震蕩提取 3 min ，靜置 30 min 以上，12000 rpm 4 ℃ 離心 15 min。室溫靜置，去除上層浮脂，取上清液待凈化。
1.2 試樣凈化
1.2.1 活化：HyperSep 肝素親和柱 (P/N: 60105-110-B) 下端 Luer 接頭連接至固相萃取裝置，上端通過(guò)適配器 (P/N: 60104-259) 串聯(lián) 10 mL 注射器空筒， 加入 2×5 mL 磷酸鹽緩沖液Ⅱ活化肝素親和，控制滴速 2d/3s；
1.2.2 上樣：待活化步驟液面接近小柱篩板時(shí)，準(zhǔn)確移取 10.0 mL 上述樣液至注射器空筒 (P/N: S7510-10) 中，控制滴速 2d/3s，棄去流出液；
1.2.3 淋洗：待上樣步驟液面接近小柱篩板時(shí)，加入 2×5 mL 磷酸鹽緩沖液Ⅱ淋洗小柱，棄去流出液，移除適配器和注射器空筒，負(fù)壓抽干小柱 2 min；
1.2.4 洗脫：加入 2×2.5 mL 磷酸鹽緩沖液Ⅰ洗脫，收集全部洗脫液，并用磷酸鹽緩沖液Ⅰ定容至 5.00 mL，過(guò) 0.2 μm 親水性 PTFE 針式過(guò)濾器 (P/N: 42213-NPL) ，濾液待上機(jī)測(cè)試。
02
儀器配置及色譜條件
Thermo Scientific™ Vanquish Core™ 高效液相色譜系統(tǒng)，配置：泵 Quaternary Pump C (VC-P20-A)，自動(dòng)進(jìn)樣器 Split Sampler CT (VC-A12-A)，柱溫箱 Column Compartment C (VC-C10-A)，檢測(cè)器 Diode Array Detector CG (VC-D11-A)，數(shù)據(jù)處理 Chromeleon™ 7.3
色譜柱：BioBasic 4, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 72305-254630)
流動(dòng)相：A: 0.1% 三氟乙酸水 B: 0.1% 三氟乙酸乙腈
流速：1.0 mL/min
梯度洗脫程序：
進(jìn)樣量：50 µL
柱溫：30 ℃
檢測(cè)器：DAD, 采集波長(zhǎng): 280 nm；采集頻率: 5 Hz；光譜采集: 190-400 nm
03
譜圖及數(shù)據(jù)
3.1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分離譜圖及數(shù)據(jù)
圖 1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分離譜圖及數(shù)據(jù) (50.0 μg/mL)(點(diǎn)擊查看大圖)
如圖 1 所示，乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (50.0 μg/mL) 保留時(shí)間為 12.137 min，色譜峰形良好，不對(duì)稱因子 1.00，柱效優(yōu)異，理論塔板數(shù) 30549。乳鐵蛋白在 280 nm 處有特征吸收峰。
3.2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣疊加譜圖
圖 2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣疊加譜圖 (50.0 μg/mL, n=3)(點(diǎn)擊查看大圖)
乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (50.0 μg/mL) 連續(xù)三次進(jìn)樣，保留時(shí)間和峰面積的 RSD 均小于 1%，方法重現(xiàn)性好，分離譜圖及數(shù)據(jù)詳見(jiàn)圖 2。
3.3 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液校準(zhǔn)曲線疊加譜圖
圖 3 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液校準(zhǔn)曲線疊加譜圖 (1.00/5.00/10.0/50.0/100/200 μg/mL)(點(diǎn)擊查看大圖)
如圖 3 所示，乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性范圍 1.00-200 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù) r2≥0.9998，線性良好。
3.4 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性最低點(diǎn)與空白溶液疊加譜圖
圖 4 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性最低點(diǎn) (1.00 μg/mL) 與空白溶液疊加譜圖(點(diǎn)擊查看大圖)
當(dāng)進(jìn)樣體積為 50 uL 時(shí)，以乳鐵蛋白 (1.00 μg/mL) 的峰高為 S，選取 10.5-11.5 min 基質(zhì)噪音的平均值為 N，線性低點(diǎn)信噪比 S/N=8.2，如圖 4 所示，乳鐵蛋白測(cè)定方法靈敏度相對(duì)較高。
3.5 在 0.1% 三氟乙酸水-乙腈流動(dòng)相體系下，乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰形及響應(yīng)
圖 5 在 0.1% 三氟乙酸水-乙腈流動(dòng)相體系下，乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品溶液疊加譜圖(點(diǎn)擊查看大圖)
如圖 5 所示，當(dāng)流動(dòng)相 B 為純乙腈時(shí)，乳鐵蛋白峰形會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾，導(dǎo)致線性最低點(diǎn) (1.00 μg/mL) 響應(yīng)較差，無(wú)法自動(dòng)積分，方法檢出限不能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。綜合乳鐵蛋白行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T 4439-2023 和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn) T/TDSTIA 006-2019 推薦的色譜條件，本試驗(yàn)最終選擇 0.1% 三氟乙酸水-0.1% 三氟乙酸乙腈 作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，且系統(tǒng)最大壓力值不超過(guò) 106 bar。
3.6 巴氏殺菌乳（低溫奶）、超高溫滅菌乳（常溫奶）及嬰幼兒配方奶粉樣品溶液分離譜圖
圖 6 巴氏殺菌乳(低溫奶)樣品溶液分離譜圖(點(diǎn)擊查看大圖)
圖 7 超高溫滅菌乳(常溫奶)樣品溶液分離譜圖(點(diǎn)擊查看大圖)
圖 8 嬰幼兒配方奶粉樣品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù)(點(diǎn)擊查看大圖)
乳鐵蛋白對(duì)溫度非常敏感，高溫會(huì)破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性，使得肝素親和柱無(wú)法有效富集。如圖 6-8 所示，巴氏殺菌乳(低溫奶)中乳鐵蛋白含量為 13.4 mg/kg；而超高溫滅菌乳(常溫奶)和嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白均為未檢出。
04
GB 5009.299-2024 相關(guān)色譜耗材推薦
分析柱及保護(hù)柱
BioBasic 4, 5 μm, 4.6×250 mm
(P/N: 72305-254630)
BioBasic 保護(hù)柱柱芯, 5 μm, 4.0×10 mm, 4 pk
(P/N: 72305-014001)
Uniguard 直連式保護(hù)柱柱套
(P/N: 850-00)
樣品前處理
HyperSep 肝素親和柱，3 mg, 10/pk
(P/N: 60105-110-B)
HyperSep 玻璃室真空固相萃取裝置，16 位
(P/N: 60104-232)
適配器，適用于 1 mL、3 mL、6 mL SPE 小柱轉(zhuǎn)接，15/pk
(P/N: 60104-259)
National Target 全塑料一次性注射器，Luer-Slip, 10 mL, 100/pk
(P/N: S7510-10)
Titan 3 親水性 PTFE 針式過(guò)濾器，17 mm, 0.2 μm, 200/pk
(P/N: 42213-NPL)
05
參考文獻(xiàn)
[1] GB 5009.299-2024 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中乳鐵蛋白的測(cè)定
[2] NY/T 4439-2023 奶及奶制品中乳鐵蛋白的測(cè)定 高效液相色譜法
[3] T/TDSTIA 006-2019 奶及奶制品中乳鐵蛋白的測(cè)定 液相色譜法
[4] T/CCAA 70-2023 牛乳基嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
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