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　　在往期分享中，我們介紹了IVIS成像系統(tǒng)在動物水平的眾多應(yīng)用，其實IVIS同樣可以用于全植物成像。此次我們就分享IVIS在水稻氮代謝研究中的應(yīng)用。
 

　　氮是植物生長發(fā)育所必需的養(yǎng)分，但其在土壤中的濃度往往達不到佳作物生長濃度。因此，提高作物氮素利用率被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的一個主要目標(biāo)。然而，關(guān)于作物氮代謝仍有許多需要了解的地方。
 

　　在此，研究人員開發(fā)了一個分子傳感器系統(tǒng)來監(jiān)測水稻中氮的狀態(tài)，該方法發(fā)表在《Frontiers in Plant Science》雜志上。研究中首先利用該系統(tǒng)研究了尿囊素的作用，尿囊素分解為尿囊素衍生的代謝物，在低濃度下作為氮源使用。參與尿素代謝的兩個基因尿囊素酶(OsALN)和尿素滲透酶1 (OsUPS1)，對氮狀態(tài)高度敏感，在低氮條件下，OsALN迅速上調(diào)，而高氮條件下OsUPS1表達上調(diào)。基于上述機制，研究人員培育了含有氮分子傳感器系統(tǒng)的[proALN::ALN-LUC2]和[proUPS1::UPS1-LUC2]轉(zhuǎn)基因水稻。這種轉(zhuǎn)基因的表達可以模擬內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，即OsALN和OsUPS1基因?qū)ν庠碞狀態(tài)的響應(yīng)。
 

　　文中使用兩種方法來測定分子氮傳感器的能力：
 

　　方法一：在長期培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)基因水稻植株在高濃度氮源培養(yǎng)基(GM+N)或不含氮源的生長培養(yǎng)基(GM-N)中培養(yǎng)5天，隨后使用IVIS活體成像系統(tǒng)進行成像及定量。
 

　　結(jié)果顯示，生長在GM+N培養(yǎng)基中的 proUPS1::UPS1-LUC2 水稻植株表現(xiàn)出更高的熒光素酶活性(圖1A)。為了對發(fā)光信號進行定量，研究人員測定了5個獨立的純合系(具有單個基因拷貝)。生長在GM+N培養(yǎng)基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株發(fā)光信號強于GM-N組20倍，而強于對照組約2,800倍(圖1B)。
 

　　方法二：在短期培養(yǎng)實驗中，轉(zhuǎn)基因水稻植株先在GM-N培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，第5天在加入100nM硫酸銨。結(jié)果顯示，同長期實驗結(jié)果一樣，生長在后期加 氮培養(yǎng)基中proUPS1::UPS1-LUC2 植株，發(fā)光信號更強(圖1C)。同樣對5株獨立的純合系進行了定量，生長在后期加N培養(yǎng)基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株生物發(fā)光信號強于GM-N培養(yǎng)基中約50倍，而強于對照組13,000倍(下圖1D)。

　　圖1.在高氮培養(yǎng)條件下，proUPS1::UPS1-LUC2 具有很強的發(fā)光信號。
 

　　(A)對照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM+N或者GM–N培養(yǎng)基 中培養(yǎng)5天；
 

　　(B)5個獨立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(A)條件下，發(fā)光定量結(jié)果；
 

　　(C)對照組和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM–N生長5天, 或者在GM–N培養(yǎng)基中生長4天，然后加入100 mM硝酸銨培養(yǎng)1天；
 

　　(D)5個獨立的純合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(C)條件下的定量結(jié)果，以對照組作為基準(zhǔn)進行標(biāo)準(zhǔn)化 。
 

　　這些結(jié)果說明，proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器能夠通過發(fā)光信號水平檢測外源氮的情況。
 

　　同樣在研究中對proALN::ALN-LUC2 植株進行了相同的處理。結(jié)果顯示，在長時間的培養(yǎng)實驗中，GM+N和GM-N培養(yǎng)基生長的proALN::ALN-LUC2 沒有明顯差異(圖2A)。對5株獨立的純品系進行發(fā)光信號定量，相比GM+N培養(yǎng)基，GM-N培養(yǎng)基生長的proALN::ALN-LUC2 植株發(fā)光信號要高約1.8倍，比對照組高約17倍(圖2B)。因此很難鑒定GM+N和GM-N培養(yǎng)基對生長的影響。而在短時間培養(yǎng)實驗中，連續(xù)生長在GM-N培養(yǎng)基中的proALN::ALN-LUC2，發(fā)光信號要強于加高氮培養(yǎng)1天的。

 

　　圖2.在低氮培養(yǎng)條件下，proALN::ALN-LUC2 植株顯示強的生物發(fā)光信號。
 

　　(A)對照組和proALN::ALN-LUC2 植株，在GM+N or GM–N培養(yǎng)基中培養(yǎng).；
 

　　(B)A組相對定量結(jié)果；
 

　　(C)對照和proALN::ALN-LUC2 植株在 GM–N中培養(yǎng)5天，或者在GM–N培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，然后加入100 mM 硝酸銨再培養(yǎng)1天 ；
 

　　(D)C組相對定量結(jié)果；GM–N培養(yǎng)基生長的對照組植株作為基準(zhǔn)進行標(biāo)準(zhǔn)化。
 

　　此外，在文章中，還利用IVIS活體成像系統(tǒng)，探討了該傳感器對于氮源是否具有選擇性及對于氮源的敏感性。結(jié)果顯示proUPS1::UPS1-LUC2 和proALN::ALN-LUC2 對于氮源無特異性，可以廣泛的作為水稻等植株中分子氮的傳感器。并且proUPS1: UPS1-LUC2 植株在硝酸銨、硫酸銨或硝酸鉀濃度> 1mM即表現(xiàn)出強烈的生物發(fā)光信號，而低氮濃度(< 0.01mM)信號減弱。0.1mM硝酸鉀proUPS1:: UPS1-LUC2 植株誘導(dǎo)強烈的生物發(fā)光信號，而0.1mM硝酸銨和硫酸銨則沒有。這表明， proUPS1::UPS1-LUC2 傳感器監(jiān)測高氮狀態(tài)，低氮狀態(tài)。proALN::ALNLUC2 在低氮濃度(<0.1 mM)下表現(xiàn)出較強的熒光素酶活性，而在高氮濃度下表現(xiàn)出較弱的活性(> 10mM)。
 

　　綜上，分子氮傳感器的信號反映了分子氮的內(nèi)部狀態(tài)。結(jié)合IVIS活體成像技術(shù)，proALN::ALN-LUC2和proUPS1::UPS1-LUC2 可作為分子傳感器在不同研究中監(jiān)測大米內(nèi)部氮狀態(tài)。
 

　　文獻來源：Dong-Keun Lee, Mark C. F. R. Redillas, Harin Jung, Seowon Choi, Youn Shic Kim and Ju-Kon Kim. A Nitrogen Molecular Sensing System, Comprised of the ALLANTOINASE and UREIDE PERMEASE 1 Genes, Can Be Used to Monitor N Status in Rice. Front. Plant Sci, 18 April 2018.