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復方中藥提取物增強免疫力作用及初步機制研究丨環特斑馬魚研究
發布時間：2022-4-2近期，無限極（中國）有限公司與環特生物在期刊《中國實驗動物學報》上聯合發表題為 《復方中藥提取物增強免疫力作用及初步機制研究》的全新研究成果。該項目通過體外細胞和體內斑馬魚實驗，快速評價復方中藥提取物增強免疫力作用，并進行了初步機制研究。
在體外實驗中利用 RAW 264.7 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞初步評價復方中藥提取物的生物活性；再以酒石酸長春瑞濱誘導建立斑馬魚活體免疫低下模型，分別從斑馬魚巨噬細胞生成和吞噬功能、T 細胞生成及相關炎癥、免疫基因的表達等多個方面，觀察復方中藥提取物的干預作用。
該研究顯示，體外實驗中復方中藥提取物有良好的生物安全性，其在250μg/mL 條件下可提高酒石酸長春瑞濱誘導后的RAW264.7小鼠單核巨噬細胞存活率。體內研究表明，復方中藥提取物在222、667、2000 μg/mL 濃度時均可明顯改善長春瑞濱誘發的斑馬魚巨噬細胞數量的減少，同時增強巨噬細胞吞噬能力；222、667μg/mL濃度可顯著增加 T 細胞熒光強度；222、667、2000μg/mL 濃度均可明顯恢復模型對照組中rag1、rag2基因相對表達量被下調的情況，并均可以顯著下調模型斑馬魚TNF-α基因相對表達量；復方中藥提取物222μg/mL可顯著上調免疫因子IL-12基因表達量，在2000μg/mL時顯著上調 IFN-γ 基因表達量。
該研究基于體外細胞和體內斑馬魚實驗結果表明，復方中藥提取物具有明顯的增強免疫力作用，為復方中藥提取物作為新的免疫保健食品和二次開發提供了指導性依據。
● 綜述
免疫力可以保護機體不受侵害，近年來，由于生態失衡所導致的免疫性疾病越來越多，西藥不能起到預防作用，治療效果不甚明顯且存在毒副作用。而中藥及其提取物在中醫藥基礎理論指導下，擅治未病，講究協調和平衡，且毒副作用小，所以中藥及其提取物增強免疫力一直是新研究方向。
已有實驗研究表明，靈芝多糖和生物堿均能明顯增強小鼠巨噬細胞吞噬能力和 T 淋巴細胞轉化能力，同時可提高小鼠外周血中 IFN-γ 的表達水平。五味子多糖、白術多糖及內酯均具有抗氧化和增強機體免疫力活性；菟絲子提取物是有效的抗菌劑，抗氧化劑和抗炎劑；黨參和茯苓在多種急性和慢性炎癥的不同實驗模型中顯示抗炎活性。然而大部分研究都是以傳統的大小鼠為動物模型進行評價，具有造模時間長、成本高、通量小等缺點。
斑馬魚（Danio rerio，zebrafish）是一種國際認可的新型模式生物，其引人注目的優勢是胚胎發育的透明性，基于高通量的檢測體系，以及短時-高效-低費篩選。隨著“3R（reduction，replacement，refinement）原則"的推行與實施，其在藥物的靶點鑒別、疾病的模型開發和毒性評價中應用越來越廣泛。
本研究采用體外細胞實驗和體內斑馬魚免疫低下模型探究復方中藥提取物對免疫力的影響，從RAW 264.7 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞活性，斑馬魚巨噬細胞數量及其吞噬功能，T 細胞數量，免疫相關基因水平多方面考察復方中藥提取物的生物安全性與增強免疫作用，對復方中藥提取物增強免疫功能進行驗證并提供理論依據。
● 項目研究結果
在體外實驗中復方中藥提取物有良好的生物安全性，且可明顯提高酒石酸長春瑞濱誘導后小鼠單核巨噬細胞的存活率。
體內研究表明，復方中藥提取物可明顯改善長春瑞濱誘發的斑馬魚巨噬細胞及 T 細胞數量的減少，同時增強體內巨噬細胞的活性和吞噬能力；復方中藥提取物可明顯恢復模型對照組中rag1、rag2 基因相對表達量被下調的情況，復方中藥提取物上調免疫因子 IL-12 的表達量、IFN-γ 基因的相對表達量，復方中藥提取物可顯著下調 TNF-α 基因相對表達量。
體內、外實驗表明復方中藥提取物具有明顯的增強免疫力作用。綜上所述，復方中藥提取物具有明顯的抗炎及增強免疫力的作用。本研究可為復方中藥提取物作為新的免疫保健食品和二次開發提供指導性依據。
● 相關實驗
1. 復方中藥提取物對RAW264.7細胞存活率的影響
當復方中藥提取物濃度為 62.5 ~ 250 μg/mL 時，RAW 264.7 細胞存活率均 > 90.0%；當復方中藥提取物濃度為 500 μg/mL 時，RAW 264.7 細胞存活率下降為 84.0%。故確定復方中藥提取物對 RAW 264.7 細胞安全濃度為 250 μg/mL（見表 1）。
由表 2 可知，酒石酸長春瑞賓可導致 RAW 264.7 細胞存活率顯著下降；同時復方中藥提取物 3 倍濃度梯度干預后，細胞存活率呈劑量依賴性升高，復方中藥提取物 250 μg/mL 可顯著提高 RAW 264.7 細胞存活率（P< 0.01）。
2. 復方中藥提取物對斑馬魚的MTC
在實驗終點，復方中藥提取物62.5~2000μg/mL濃度組斑馬魚均未見明顯異常，各臟器和行為狀態與正常斑馬魚相似（見圖1）。提示復方中藥提取物對正常斑馬魚的 MTC為2000μg/mL。
3 復方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞生成的影響
由統計結果可知（表3，圖2），酒石酸長春瑞賓可導致斑馬魚免疫力低下，表現為與正常對照組比較，酒石酸長春瑞賓組斑馬魚中巨噬細胞熒光強度顯著降低；復方中藥提取物低、中、高3倍濃度梯度干預后，巨噬細胞熒光強度均顯著升高，巨噬細胞減少的改善功效分別為18%（P<0.05）、21%（P<0.01）和 22%（P<0.01）。
4 復方中藥提取物對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能的影響
由統計結果可知（表4，圖3），與模型對照組比較，復方中藥提取物低、中、高3個濃度組均可明顯減少斑馬魚體內熒光微球殘留數目（P< 0.05），表明復方中藥提取物具有促巨噬細胞吞噬功能作用。
5 復方中藥提取物對斑馬魚T細胞生成的影響
由統計結果可知（表5，圖4），與正常對照組比較，模型對照組T細胞熒光強度極顯著降低，表明酒石酸長春瑞賓可誘導斑馬魚免疫抑制。與模型對照組比較，復方中藥提取物中濃度T細胞熒光強度顯著升高（P<0.01）；但高濃度對T細胞熒光強度無升高作用且呈現降低的作用趨勢。
6 復方中藥提取物對斑馬魚 T 細胞的影響及初步機制研究
6.1 RNA 濃度及純度
在實驗終點，提取斑馬魚總RNA，用超微量分光光度計測定RNA濃度及純度（A260/A280 比值），結果表明 A260/A280 比值均在1.88~2.03之間，表明提取得到斑馬魚總 RNA 質量較好，可用于后續q-PCR實驗（見表 6）。
6.2 對重組激活型基因rag1和rag2的影響
根據基因相對表達量公式計算，與正常對照組比較，模型對照組rag1、rag2基因相對表達量均顯著下調（P<0.01），復方中藥提取物干預后，低、中、高濃度組rag1、rag2基因相對表達量均顯著恢復（見表7）。
6.3 對免疫因子IL-12和IFN-γ的影響
與正常對照組比較，模型對照組IL-12基因相對表達量極顯著下調（P< 0.001），復方中藥提取物干預后，在實驗終點，低濃度組IL-12基因相對表達量極顯著上升（P< 0.001），中、高濃度組出現負反饋調節。
與正常對照組比較，模型對照組IFN-γ基因相對表達量顯著下調（P< 0.01），復方中藥提取物3倍濃度梯度干預后，IFN-γ基因相對表達量呈劑量依賴性恢復，復方中藥提取物高濃度組 IFN-γ 基因相對表達量極顯著上升（P< 0.001）（見表8）。
6.4 對致炎癥因子 TNF-α 的影響
模型對照組TNF-α基因相對表達量（1.000）與正常對照組（0.006）比較極顯著上調（P< 0.001）。復方中藥提取物低、中、高濃度組TNF-α基因相對表達量分別為 0.023、0.002 和 0.008（P<0.001），提示復方中藥提取物可顯著下調TNF-α基因相對表達量（見表9）。
● 討論
復方中藥提取物是靈芝、五味子、白術、菟絲子、茯苓和黨參提取物為主要原料，在之前的研究中，這六味中藥提取物均具有增強免疫力相關報道；此外，菟絲子、黨參和茯苓在多種急性和慢性炎癥模型中顯示強抗炎活性。
在本實驗條件下，體外細胞實驗中當復方中藥提取物在62.5~250 μg/mL時，RAW264.7細胞存活率均>90.0%，表明復方中藥提取物具有良好的生物安全性，且在巨噬細胞的免疫作用方面，對于降低免疫力的造模劑來說，復方中藥提取物也有很好的改善作用，與對照組相比，細胞活性上升，這可能是因為復方中藥提取物主要原料的安全性和促進免疫力的作用。例如靈芝多糖可影響免疫細胞和免疫相關細胞，包括促進B和T淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞活性。
復方中藥提取物同時在本次實驗中表現出較好的改善免疫力低下模型中巨噬細胞數量和吞噬能力，以及T細胞的熒光強度，表明復方中藥提取物在體內實驗中能有效的增強機體免疫力，在之前的報道中，復方中藥提取物中具備的靈芝提取物可下調LPS誘導的促炎因子，并促進 BV-2 和原發性小膠質細胞的抗炎細胞因子表達。
另外，靈芝提取物通過改變巨噬細胞吞噬作用從而達到先天免疫應答的激活，對于基因表達水平方面，不同濃度的復方中藥提取物對免疫力低下模型抗炎因子水平的恢復，以及致炎因子水平的降低可以很好的從分子機制解釋復方中藥提取物的增強免疫力的原理，另外相當多的研究對復方中藥提取物中的中藥成分免疫基因水平的表達給出了很好的解釋，例如五味子可通過增加衰老小鼠的血清IL-2，IL-4，IFN-γ，lgG，lgM 和lgA的水平，降低TNF-α和IL-6的含量，并增加白血球數量，吞噬活性，淋巴細胞增殖和體外脾臟指數去增強衰老小鼠的免疫力。
這些研究都為本實驗提供了有效的實驗依據的支撐，復方中藥提取物的增強免疫力功效也均與之報道相符合。