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CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，圖片來自于McGovern Institute for Brain Research at MIT

2020年10月，Jennifer A. Doudna（加州大學(xué)伯克利分校）和Emmanuelle Charpentier（馬克斯普朗克研究所）因 “開發(fā)了一種基因組編輯技術(shù)”共同榮獲諾貝爾化學(xué)獎。

自此，CRISPR基因編輯技術(shù)，這一名副其實的“基因剪刀手”技術(shù)，通過對目標(biāo)基因DNA片段進行刪除、替換、插入、定點突變等“精確編輯”操作，以獲得新的功能或表型，甚至創(chuàng)造新的物種，成為了風(fēng)靡全球生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)嶒炇业膶檭海粡V泛應(yīng)用于大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅等動植物（細胞）及細菌等微生物的基因組靶向改造，并已在功能基因組研究、疾病防治、動植物育種、動物疾病模型開發(fā)、基因治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

正如《自然》雜志2021年科學(xué)新聞的介紹中所說：“CRISPR基因編輯技術(shù)自問世以來，一直被視為治療疾病的規(guī)則改變者。但是，要使這個夢想成為現(xiàn)實，許多疾病將需要研究人員成功地將CRISPR-Cas9植入人體，并證明它安全有效地編輯了目標(biāo)基因。”

01、斑馬魚與CRISPR基因編輯技術(shù)

2013年2月，CRISPR/Cas9技術(shù)被成功應(yīng)用于斑馬魚；2015年，來自美國NIH的研究人員進行了一項研究，他們利用CRISPR-CAS9技術(shù)靶向斑馬魚特定DNA序列進行基因功能探索和人類治病基因的發(fā)現(xiàn)研究，相關(guān)研究成果在線發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊Genome Research。（doi:10.1101/gr.186379.114）

在這項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)利用基因編輯技術(shù)CRISPR-CAS9進行斑馬魚基因靶向識別以及插入刪除特定基因的效率可以達到其他技術(shù)的6倍。同時，利用CRISPR-CAS9技術(shù)還能夠在同一時間對多個基因進行靶向突變，為研究基因功能提供了很大便利。

CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)技術(shù)能快速、簡便、準(zhǔn)確地實現(xiàn)基因組敲除等編輯功能，因而，成為了一種對微生物、動植物以及人類基因組進行基因篩選、修飾的強有力工具。

CRISPR-Cas9 在全基因組篩選中，不僅可以靶向蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，還可以靶向基因調(diào)控區(qū)域；不僅可以靶向DNA，還可以靶向microRNA、lncRNA 等 RNA序列等。在醫(yī)療保健領(lǐng)域，CRISPR-Cas9基因編輯為治愈遺傳病、癌癥，乃至心臟病等重大疾病帶來了希望。

斑馬魚，作為一種已完成基因測序的模式生物，其與人類基因同源性高達87%，且具有飼養(yǎng)成本低、產(chǎn)卵量大、發(fā)育周期短、透明易觀察等優(yōu)點，在進行高通量篩選、基因編輯時具有其他動物不可比擬的優(yōu)勢。

復(fù)雜的基因編輯加上實時高分辨率成像，分子細節(jié)和分辨率對疾病發(fā)展過程進行捕捉以及疾病的建模。

至關(guān)重要的是，對斑馬魚進行精確的基因編輯，可以生成人類疾病等位基因的模型，在斑馬魚身上建模的疾病通常代表了人類疾病的真實模型，捕捉了疾病的病因?qū)W、進展和解決過程，廣泛應(yīng)用于各種癌癥、遺傳病、肝臟疾病、心腦血管疾病、血液疾病、心臟病、行為障礙、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等等。

通過斑馬魚CRISPR基因編輯技術(shù)，不僅可以用來評價人類基因的作用與功能、解析其在遺傳與發(fā)育上發(fā)揮作用的分子機制，而且可以通過基因組改造（基因敲除、敲入和轉(zhuǎn)基因等）構(gòu)建先天性心臟病、慢性心衰、擴張型心肌病、癌癥等各種人類疾病的斑馬魚模型，表型模擬人類疾病的病癥，通過高通量藥物篩選技術(shù)，用于篩選和發(fā)現(xiàn)相關(guān)的治療靶點藥物和化合物，研究分子遺傳病的病理機制、確認疾病的致病基因、開發(fā)基因治療的生物藥等生物醫(yī)藥的研發(fā)，從而助力人類健康醫(yī)學(xué)的研究與實驗新發(fā)現(xiàn)。

02、環(huán)特生物的基因編輯技術(shù)服務(wù)

環(huán)特生物提供各種斑馬魚CRISPR基因敲入、敲除、定制轉(zhuǎn)基因技術(shù)服務(wù)以及斑馬魚疾病模型開發(fā)等相關(guān)服務(wù)，助力基因功能研究。斑馬魚基因敲入技術(shù)與基因置換技術(shù)，為您利用斑馬魚遺傳模型鋪平道路，與您攜手推動生物科學(xué)和人類健康事業(yè)發(fā)展！

基因敲除技術(shù)

定義：根據(jù)給定GeneID或Gene name，分析基因保守結(jié)構(gòu)域，在保守結(jié)構(gòu)域或客戶區(qū)域設(shè)計靶點并制備靶點gRNA，gRNA和Cas9共注射使基因產(chǎn)生移碼突變，通過PCR篩選得到穩(wěn)定遺傳品系。

技術(shù)特點：

通過將基因敲除斑馬魚品系與野生型相比較，研究者可以揭示特定基因的功能；

在基因組水平上將目標(biāo)基因敲除，遺傳背景干凈清晰，是研究基因功能的金標(biāo)準(zhǔn)。

服務(wù)流程：

▲根據(jù)客戶提供的GeneID或Gene name進行基因分析；

▲cas9 mRNA和多個gRNA靶點的設(shè)計及合成；

▲高效gRNA靶點的篩選及效率驗證；

▲F0代斑馬魚的可遺傳性篩選；

▲雜合子F1代斑馬魚的基因型鑒定。

定制轉(zhuǎn)基因斑馬魚

定義：斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)包括顯微注射、電穿孔技術(shù)（電脈沖介導(dǎo)）、jingzi載體法、GAL4/UAS 轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)、Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)、擬型反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)、重組桿狀病毒介導(dǎo)等方法。

技術(shù)目的：

通過定點敲除技術(shù)進行基因鑒定和功能研究；

利用報告基因?qū)κ荏w等蛋白質(zhì)進行功能研究；

構(gòu)建各種斑馬魚突變體，通過斑馬魚疾病模型進行人類疾病研究和藥物篩選；

構(gòu)建含有特異性啟動子的生物感應(yīng)器，用于環(huán)境監(jiān)測。

技術(shù)優(yōu)點：

Tol2轉(zhuǎn)座子可攜帶大片段DNA；

Tol2轉(zhuǎn)座子沒有位置偏好性，幾乎能整合到染色體的任意位置；

Tol2轉(zhuǎn)座子的耐受范圍很廣；

Tol2作為天然的具有自主轉(zhuǎn)座活性的脊椎動物轉(zhuǎn)座子，能夠在胚胎發(fā)育的不同時期進行有效的轉(zhuǎn)移；

Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠有效克服外源基因在后代傳遞頻率低的技術(shù)難題。

服務(wù)流程：

▲客戶提出轉(zhuǎn)基因品系制備需求；

▲分析可行性；

▲構(gòu)建載體；

▲斑馬魚胚胎注射；

▲founder篩選；

▲F1代斑馬魚養(yǎng)殖；

▲F2代斑馬魚養(yǎng)殖。

基因敲入技術(shù)

定義：非同源依賴的DNA修復(fù)技術(shù)，在斑馬魚基因組定點插入外源DNA片段（熒光蛋白、PA等）。

技術(shù)特點：定點插入。

服務(wù)流程：

▲根據(jù)客戶基因敲入要求進行基因分析；

▲cas9 mRNA和多個gRNA靶點的設(shè)計及合成；

▲高效gRNA靶點的篩選及效率驗證；

▲敲入載體設(shè)計及構(gòu)建；

▲斑馬魚胚胎的顯微注射和敲入驗證；

▲F0代斑馬魚的可遺傳性篩選；

▲雜合子F1代斑馬魚的基因型鑒定。

斑馬魚CRISPR基因編輯技術(shù)

敲入、敲除、轉(zhuǎn)基因……

快來與環(huán)特生物一起，

以斑馬魚生物科技

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