制藥網
技術文章
環特斑馬魚研究丨斑馬魚腫瘤異種移植模型在抗癌藥敏感性評價中的應用
發布時間：2022-6-29
目的：應用人類肺癌、胃癌和肝癌細胞斑馬魚異種移植模型，分別評價５種臨床常用抗癌藥的體內敏感性。方法 ：分別建立斑馬魚肺癌 Ａ549、胃癌SGC-7901和肝癌ＨepＧ２ 異種移植模型，順鉑、紫杉醇、長春瑞濱、恩度和貝伐單抗設計３個劑量分別處理斑馬魚肺癌Ａ549 移植模型，紫杉醇、伊立替康、羥基脲、順鉑和５?氟尿嘧啶（５?fluorouracil，５-FU）設計2個濃度或劑量分別處理斑馬魚胃癌SGC-7901移植模型，阿霉素、吉西他濱、羥基脲、順鉑和 ５?氟尿嘧啶設計3個濃度或劑量分別處理斑馬魚肝癌ＨepＧ2移植模型。實驗結束后，使用熒光顯微鏡進行體內腫瘤定量圖像分析，計算藥物對斑馬魚體內腫瘤生長抑制率，通過與模型對照組相比，分析是否具有統計學意義。
結果：受試的抗腫瘤藥物在斑馬魚腫瘤異種移植模型中均有效，并且基本都呈劑量依賴性。在抗肺癌 Ａ549藥敏試驗中，藥效從高到低分別為貝伐單抗（65％）＞順鉑（55％）＞長春瑞濱（40％）＞恩度（39％ ）＞紫杉醇（27％）；在抗胃癌SGC-7901藥敏試驗中，藥效從高到底分別為羥基脲（46％ ）＞ ５-FU（31％ ）＝伊立替康（31％ ）＞紫杉醇（26％ ） ＞ 順鉑（24％ ）；在抗肝癌ＨepＧ2藥敏試驗中，藥效從高到底分別為順鉑（64％ ） ＞ 羥基脲（56％ ）＞吉西他濱（46％ ）＞ 阿霉素（４５％ ）＞ ５-FU（38％ ）。結論：斑馬魚腫瘤異種移植模型適合用于抗癌藥體內藥敏試驗。
● 綜述
世界上每年都會出現大量新的抗腫瘤候選物，大量的人力物力不斷地投入到抗腫瘤藥物的開發中，然而，每年都有大量的抗腫瘤藥物在前期的開發中給科學家帶來希望，但在后期的臨床研究中被證明是無效的，由此造成的時間、金錢、精力成本巨大。 因此，尋找一種在藥物開發早期便能夠迅速、準確、高效評價抗腫瘤候選物藥效的方法非常必要。
斑馬魚作為一種重要的模式生物，早期主要應用于發育遺傳學研究和有毒物質的檢測 。近些年來，斑馬魚在各類藥物的藥效評價方面也起到了越來越重要的作用 。斑馬魚作為一種整體的活體動物模型，在藥物評價方面，具備藥物在體內吸收、分布、代謝、排泄的完整過程，并且由于其本身的物理特性，斑馬魚又具有類似體外細胞、分子生物學手段快速、高效、經濟的優勢，是細胞等體外試驗模型過渡到鼠科等哺乳動物模型中的一個優勢動物模型，在藥物的臨床前研究階段有較高應用價值。
斑馬魚腫瘤異種移植模型是抗腫瘤藥物研發中一種新興的實驗技術，廣泛應用于抗腫瘤藥物的早期篩選實驗 ，但并未見關于使用該模型專門評價已上市藥物藥敏性的報道。 因此，本研究以斑馬魚腫瘤移植為動物模型，驗證臨床常用的抗腫瘤藥物在該模型上的藥敏性，旨在探索斑馬魚腫瘤異種移植模型是否能夠準確評價抗腫瘤藥物的效果，為該模型應用于抗癌藥物的研發提供實驗依據。
● 實驗部分
1.1 斑馬魚腫瘤異種移植模型的建立
將標記好的細胞進行細胞計數，調整濃度為 ３×107個細胞／ｍＬ，使用顯微注射儀將細胞注射至2dpf 斑馬魚卵黃囊內，注射體積10ｎL，每尾斑馬魚約注射300個細胞。 注射細胞后的斑馬魚放置35℃恒溫生化培養箱培養，24ｈ后在熒光顯微鏡下篩選熒光量一致的斑馬魚，按實驗設計進行分組，每組30尾斑馬魚。
1.2 藥物處理
根據臨床用藥相對應的方式，臨床口服藥物對應斑馬魚水溶給藥，臨床靜脈注射藥物對應斑馬魚靜脈注射給藥。 通過濃度摸索實驗，得到各抗癌藥物在斑馬魚上的耐受劑量（ ＭＴＤ）或濃度（ＭＴＣ）。 在體內藥敏試驗中，各藥物均選擇 ３ 個劑量或濃度進行實驗，分別為 ＭＴＤ／４、ＭＴＤ／２和ＭＴＤ，ＭＴＣ／４、ＭＴＣ／２ 和 ＭＴＣ。抗非小細胞肺癌Ａ549細胞藥敏試驗組別和劑量設置見表 １。抗胃癌 ＳＧＣ?７９０１ 細胞藥敏試驗組別和劑量設置見表 ２。抗肝癌ＨepＧ2細胞藥敏試驗組別和劑量設置見表 ３。移植腫瘤的斑馬魚，不加任何藥物處理的為模型對照組。
1.3 熒光拍照及數據采集
抗癌藥物處理至5dpf時，每個實驗組隨機選擇10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下進行觀察、拍照并保 存 圖 片。進行圖像分析，計算癌細胞相對熒光強度總和（Ｓ） ，定量評價各抗癌藥物對斑馬魚體內腫瘤生長的抑制作用。腫瘤抑制作用計算公式如下：
統計學分析采用方差分析，與模型對照組相比較，Ｐ＜0.05為差異有顯著性。
● 實驗結果
1. 抗非小細胞肺癌A549細胞的藥敏
抗非小細胞肺癌Ａ549細胞藥敏試驗結果如表４ 和圖１所示。 其中，抗肺癌Ａ549細胞藥敏試驗中，貝伐單抗在劑量為每尾斑馬魚100、200和400ng時，腫瘤生長抑制率分別為 ４％ 、57％ 和 65％ ，與模型對照組比較分別為 Ｐ ＞0.5，Ｐ ＜ 0.001和 Ｐ ＜0.001，當貝伐單抗在劑量為每尾斑馬魚200和 400ng時對肺癌Ａ549細胞有顯著的抑制作用。 順鉑在劑量為每尾斑馬魚0.5、１ 和 ２ng時，腫瘤生長抑制率分別為34％ 、35％ 和 55％ ，與模型對照組比較，均對肺癌Ａ549細胞有顯著的抑制作用。 恩度在劑量為每尾斑馬魚20、40和80ng時，腫瘤生長抑制率分別為11％ 、12％ 和39％ ，與模型對照組比較，當在劑量為每尾斑馬魚80ng時對肺癌Ａ549細胞有顯著的抑制作用。 紫杉醇在劑量為每尾斑馬魚0.86、1.71和2.56ng時，腫瘤生長抑制率分別為24％ 、25％ 和27％ ，與模型對照組比較，均對肺癌Ａ549細胞有顯著的抑制作用。 長春瑞濱在劑量為每尾斑馬魚0.125、0.25和 0.5ng時，腫瘤生長抑制率分別為 28％ 、40％ 和40％ ，與模型對照組比較，均對肺癌Ａ549細胞有顯著的抑制作用。
可見， 抗肺癌Ａ549藥效從高到低的藥物分別為貝伐單抗（65％ ）＞ 順鉑（55％ ） ＞ 長春瑞濱（40％ ） ＞ 恩度（39％ ） ＞紫杉醇（27％ ）。
2. 抗胃癌SGC-7901細胞的藥敏
抗胃癌SGC-7901細胞藥敏試驗結果如表5和圖２所示。 其中，抗胃癌SGC-7901細胞藥敏試驗中，5-FU在濃度為65、130和260μｇ／ｍＬ時，腫瘤生長抑制率分別為31％ 、29％ 和29％ ，與模型對照組比較，均對胃癌SGC-7901細胞有顯著的抑制作用。
羥基脲在濃度為250、500和1000μｇ／ｍＬ時，腫瘤生長抑制率分別為 29％ 、31％ 和46％ ，與模型對照組比較，均對胃癌SGC-7901細胞有顯著的抑制作用。順鉑在劑量為每尾斑馬魚0.5、1和2ng時，腫瘤生長抑制率分別為 ５％ 、５％ 和24％ ，與模型對照組比較，當順鉑在劑量為每尾斑馬魚2ng時對胃癌SGC-7901細胞有顯著的抑制作用。 伊立替康在劑量為每尾斑馬魚 0.5、１和2ng時，腫瘤生長抑制率分別為4％ 、31％ 和30％ ，與模型對照組比較分別為Ｐ＞0.5，Ｐ ＜0.001和 Ｐ ＜0.001，當伊立替康在劑量為每尾斑馬魚1和2ng時對胃癌SGC-7901細胞有顯著的抑制作用。 紫杉醇在劑量為每尾斑馬魚0.86、1.71和2.56ng時，腫瘤生長抑制率分別為３％、25％和26％ ，與模型對照組比較分別為 Ｐ＞0.5，Ｐ＜0.05和 Ｐ＜0.05，當紫杉醇在劑量為每尾斑馬魚1.71和2.56ng時對胃癌SGC-7901細胞有顯著的抑制作用。
可見，抗胃癌SGC-7901藥效從高到低的藥物分別為羥基脲（46％）＞ 5-FU（31％）＝ 伊立替康（31％）＞ 紫杉醇（26％）＞ 順鉑（24％）。
3 抗肝癌HepG2細胞的藥敏
抗肝癌HepG2細胞藥敏試驗結果如表６和圖３所示。其中，抗肝癌ＨepＧ2細胞藥敏試驗中，阿霉素在劑量為每尾斑馬魚0.5、1和2ng時，腫瘤生長抑制率分別為17％、42％和45％ ，與模型對照組比較分別為Ｐ＞0.5，Ｐ＜0.001和Ｐ＜0.001，當阿霉素在劑量為每尾斑馬魚1和2ng時對肝癌HepG2細胞有顯著的抑制作用。吉西他濱在劑量為每尾斑馬魚５、10和20ng時，腫瘤生長抑制率分別為46％、45％和46％，與模型對照組比較，均對肝癌HepG2細胞有顯著的抑制作用。
羥基脲在濃度為125、250和500μｇ／ｍＬ時，腫瘤生長抑制率分別為33％ 、56％和40％ ，與模型對照組比較，均對肝癌HepG2細胞有顯著的抑制作用。順鉑在劑量為每尾斑馬魚0.5、１和２ng時，腫瘤生長抑制率分別為45％、50％和64％，與模型對照組比較，均對肝癌ＨepＧ2細胞有顯著的抑制作用。 ５?ＦＵ 在濃度為65、130和260μｇ／ｍＬ 時，腫瘤生長抑制率分別為15％ 、33％ 和38％ ，與模型對照組比較分別為Ｐ＞0.5，Ｐ＜0.01和Ｐ＜0.01，當 ５?ＦＵ 在濃度為130和260μｇ／ｍＬ時對肝癌HepG2細胞有顯著的抑制作用。
可見，抗肝癌HepG2藥效從高到低的藥物分別為順鉑（64％）＞ 羥 基 脲（56％ ）＞ 吉 西 他 濱（46％ ） ＞ 阿霉素（45％ ）＞ ５?ＦＵ（38％ ）。
● 討論
本研究選取三類人群中常見的腫瘤類型作為測試疾病對象，以臨床上每類腫瘤對應的常規化療藥物作為測試的藥物對象，以斑馬魚腫瘤異種移植模型作為檢測的生物模型，目的在于評價斑馬魚腫瘤異種移植模型是否能夠準確評價抗癌藥物的藥敏性。
本研究結果證實，在臨床上抗非小細胞肺癌藥物、抗胃癌藥物、抗肝癌藥物，在斑馬魚腫瘤異種模型上同樣能體現出其抑制癌細胞生長的效果，且明顯具有劑量依賴效應。 本實驗結果也表明，在斑馬魚腫瘤異種移植模型中，就抗腫瘤藥物對特定腫瘤的治療效果來看，各類抗腫瘤藥物的抗腫瘤效果是有優劣之分的。
對于理化性質和作用機制各異的抗癌藥物，本實驗根據臨床上的服用方式，相應地給予斑馬魚口服（水溶）給藥或者靜脈注射給藥。結果證實，這些藥物在斑馬魚體內不僅都體現出了良好的抗腫瘤效果，而且結果與臨床用藥基本一致。 這提示我們，斑馬魚腫瘤異種移植模型是一類可靠的、靈敏的、能夠在體內測定藥物抗癌效用的動物模型。
基于斑馬魚自身的物理特性優勢及對抗腫瘤藥物的藥敏性，斑馬魚腫瘤異種移植模型是一類非常有應用前景的抗腫瘤動物模型，我們預測未來該模型將會在抗腫瘤藥物的新藥研發、老藥再評價、藥物聯用組方篩選、耐藥測試乃至人源的腫瘤移植?精準醫療中獲得更加廣泛的應用。