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腦脈泰膠囊對外周神經元損傷模型斑馬魚神經再生的影響丨環特生物斑馬魚研究
發布時間：2021-11-25核心摘要
目的：探討腦脈泰膠囊治療腦梗死的可能作用機制。
方法：腦脈泰股囊用超純水溶解成50、100、 250、500、1000、1500μg/ ml6個濃度，均分別處理30尾野生型AB系斑馬魚24h后，統計各組斑馬魚死亡數量，繪制濃度效應曲線，并計算非致死濃度，篩選實驗藥物濃度。取受精后1天運動神經元轉基因熒光斑馬魚，分為空白對照組、模型組、陽性對照組和腦脈泰肢囊高、中、低劑量組，每組30尾。除空白對照組外，其余各組斑馬魚用1.5%乙醇誘導處理斑馬魚48h建立斑馬魚外周運動神經元損傷模型。造模結束后，陽性對照組給予L-甲狀腺素鈉0.08μmol/ L, 空白對照組和模型組給予養魚用水，腦脈泰膠囊低、中、 高劑量組分別給予篩選濃度的腦脈泰膠囊處理24h。藥物處理結束后，利用圖像處理軟件測量外周運動神經元的長度，計算促神經再生率。
結果：腦脈泰膠囊濃度在50、100μg/ml時，斑馬魚無死亡；濃度為 250μg/ml時斑馬魚開始出現死亡，根據濃度效應曲線得出腦脈泰肢囊非致死濃度為170μg/ml, 故本研 究選取17、57、170μg/ml為腦脈泰膠囊低、中、高劑量組干預濃度。與空白對照組比較，模型組斑馬魚外周運動神經元長度顯著縮短（P<0.01);與模型組比較，陽性對照組和腦脈泰膠囊低、 中、 高劑量組斑馬魚外周運動神經元長度增加（P<0.01) p="">0. 05 ) , 而腦脈泰膠囊低劑量組斑馬魚外周運動神經元長度降低（P<0.01）。陽性對照組和腦脈泰膠囊低、中、高組促神經再生率分別為31%、17% 、29% 、30% 。
結論：腦脈泰膠囊對外周神經元具有促神經再生作用，可能為其治療腦梗死作用機制之一。
● 綜述
腦梗死又稱缺血性卒中，中醫學稱之為卒中或 中風，是指由各種原因所致的局部腦組織區域血液供應障礙，出現腦組織缺血、缺氧，發生病變壞死 ，進而產生臨床上對應的神經功能缺失表現。腦梗死恢復期是急性期到后遺癥期的過渡階段，此階段留有不同程度的神經功能缺損，且有復發可能 ，是決定患者預后及生活能力的關鍵時期，也是臨床治療的重要時期。
腦脈泰膠囊具有益氣活血、熄風豁痰的功效，可用于腦梗死恢復期患者。既往研究表明，腦脈泰膠囊治療缺血性腦梗死有效率可達96. 79%，可顯著改善腦梗死患者的神經功能和日常生活能力評分。
斑馬魚是一種與人類同源性較高的脊椎動物，具有容易獲得、生長快速、給藥方便、胚胎透明等特性，在構建中樞神經系統疾病模型方面具有重要的效用，是研究中樞神經系統疾病和藥物研發的重要工具。本研究通過建立斑馬魚外周運動神經元損傷模型，觀察腦脈泰膠囊的干預作用，為進一步闡明腦脈泰膠囊改善腦梗死患者神經功能的可能機制提供數據支持。本研究符合實驗動物倫理學相關要求。
● 實驗方法
1. 腦脈泰肢囊非致死濃度的篩選
腦脈泰膠囊用超純水溶解，通過預實驗結果設 置 6 個 初 始 檢 測 濃度 ，分別為50、100、250、500、1000、1500μg/ml，每個濃度均處理30尾野生型AB系斑馬魚。同時設置空白對照，給予養魚用水。處理24h后，統計各組的斑馬魚死亡數量，繪制上佳的濃度效應曲線 ，并計算非致死濃度。
2. 腦脈泰肢囊對外周神經損傷斑馬魚模型的影響
取1dpf運動神經元轉基因熒光斑馬魚，實驗分為空白對照組、模型組、陽性對照組和腦脈泰膠囊高、中、低劑量組，每組30尾。除空白對照組外，其余各組斑馬魚用1.5%乙醇誘導處理斑馬魚48h，建立斑馬魚外周運動神經元損傷模型。造模結束后，陽性對照組給予超純水溶L-甲狀腺素 鈉0.08μg/ml，空白對照組和模型組給予養魚用水，腦脈泰膠囊各劑量組分別給予篩選濃度的腦脈泰膠囊處理24h。藥物處理結束后，按簡單隨機抽 樣法每組隨機挑選10尾斑馬魚，在熒光顯微鏡下拍照，進行圖像分析，定量外周運動神經元的長度（L)，計算促神經再生率。
● 實驗結果
1. 腦脈泰膠囊非致死濃度篩選結果
表1示，腦脈泰膠囊濃度在50、100μg/ml時 ，斑馬魚無死亡；濃度為 250μg/ml時，斑馬魚開始出現死亡，隨著濃度的增加斑馬魚死亡率逐漸升高。利用軟件模擬曲線（圖1) 求得腦脈泰膠囊非致死濃度為170μg/ml，故本研究選取17、57和170μg/ml為腦脈泰膠囊低、中、 高劑量組干預濃度。
圖 1 腦脈泰膠囊干預斑馬魚的濃度-致死曲線
2、各組斑馬魚外周運動神經元長度比較
表2示 ，與空白對照組比較，其余各組斑馬魚外周運動神經元長度顯著縮短（P<0.01) ; 與模型組比較，陽性對照組和腦脈泰膠囊低、中 、高劑 量組斑馬魚外周運動神經元長度增加（P<0.01); p="">0. 05),而腦脈泰膠囊低劑量組斑馬魚外周運動神經元長度縮短（P<0.01);與腦脈泰膠囊低劑量組比較，腦脈泰膠囊中、高劑量組斑馬魚外周運動神經元長度增加（P<0.01) p="">0. 05)。
● 討論
中醫藥治療腦梗死恢復期具有一定的優勢，治則以補氣血、強肝腎 、活血化瘀為主。腦脈泰膠囊以紅參大補元氣，補脾益肺；三七補益氣血， 化瘀通脈；當歸、丹參、雞血藤、紅花、銀杏葉活 血化疲；菊花、石決明 、何首烏、石菖蒲滋陰潛陽，平肝熄風，豁痰開竅；諸藥合用可益氣活血、 化瘀通絡、清心安神。
藥效學研究表明，腦脈泰膠囊可通過提高腦組織神經生長因子和降低膠質纖維 酸性蛋白表達來改善慢性腦缺血大鼠的認知功能，還能增加實驗大鼠海馬局部腦血流量，抑制海馬神經細胞凋亡。目前斑馬魚模型在帕金森綜合征、抑郁癥、癲癇、阿爾茨海默病等中樞神經系統疾病研究中得到了廣泛應用，在神經系統組織器官的再生學研究中已顯示出*的優勢。西醫治療神經損傷疾病 主要是使用營養神經藥物，但其作用機制單一，療效仍不夠理想。L-甲狀腺素鈉具有促進神經生長發育的功能，通常作為該模 型的陽性對照藥物。
本研究結果顯示，腦脈泰膠囊中、高劑量組斑馬魚外周運動神經元長度與陽性對照組差異無統計學意義，但明顯高于腦脈泰膠囊低劑量組，而腦脈泰膠囊低、中、高劑量組促神經再生率分別為17%、29%、30%, 說明腦脈泰膠囊對外周運動神經元損傷的斑馬魚促神經再生作用呈濃度依賴性， 且中、高劑量的腦脈泰膠囊與陽性對照藥L-甲狀腺素鈉效果相當，具有神經損傷的保護作用。
由于復方中成藥的成分復雜，本次實驗顯示腦脈泰膠囊對斑馬魚的非致死濃度為170μg/ml，限制了更高濃度實驗的選擇，未來將通過分離純化進一步 提高實驗的藥物濃度，明確起效的藥用部位，并選 擇更高等級的實驗動物驗證其作用，為腦脈泰膠囊改善腦梗死患者神經功能的機理研究提供依據。
作者：鐘小清，朱曉宇，徐懿喬，何勝旭
本文發表于：《中醫雜志》2021年6月第62卷第11期