2022年8月17日，遼寧師范大學七鰓鰻研究中心逄越教授課題組在《Cell Communication and Signaling》（IF: 7.525）上發表了題為“Lamprey immune protein triggers the ferroptosis pathway during zebrafish embryonic development”的研究論文[1]。

該研究團隊基于Tet-on系統構建了條件型過表達LIP轉基因斑馬魚，過表達LIP蛋白的轉基因斑馬魚出現心包和卵黃囊水腫等表型特征，心包腔出現大面積的細胞死亡，并且斑馬魚生長發育受到顯著抑制。團隊通過多個發育時間節點的RNA-seq技術，明確LIP介導鐵死亡信號通路調控生長發育。

● 綜述

2014年課題組在七鰓鰻的神經軸體（supraneural body）組織中分離并鑒定七鰓鰻免疫蛋白LIP，其對腫瘤細胞具有特異性的識別和高效率的殺傷作用[2]。2021年課題組證明miR-4561通過靶向lip調控七鰓鰻生長發育[3]。然而，LIP調控七鰓鰻生長發育的機制尚不清楚。

七鰓鰻作為一種生物，其生命周期中有幾個重要發育階段，如胚胎期、仔鰻、幼鰻、亞成體及成體期，這極大地增加了七鰓鰻的人工繁殖難度。盡管團隊已經成功實現七鰓鰻人工繁育的工作，但要將其繁育到成體期仍存在著很多的技術難題。因此，建立一個合適的七鰓鰻基因過表達或敲除模型來探究LIP的生物學功能是困難的。與七鰓鰻相比，斑馬魚遺傳背景穩定，基因組完整，遺傳操作簡單，建立轉基因斑馬魚模型是研究七鰓鰻LIP基因功能的好選擇。

研究團隊基于Tet-on系統構建了條件型過表達LIP轉基因斑馬魚，過表達LIP蛋白的轉基因斑馬魚出現心包和卵黃囊水腫等表型特征，心包腔出現大面積的細胞死亡，并且斑馬魚生長發育受到顯著抑制。團隊通過多個發育時間節點的RNA-seq技術，明確LIP介導鐵死亡信號通路調控生長發育。

● 研究結果

研究人員探究了LIP與鐵死亡發生的相關性，發現LIP過表達轉基因斑馬魚中的鐵死亡標記分子在轉錄水平和蛋白水平均出現顯著變化，LIP過表達轉基因斑馬魚表現鐵過載、脂質過氧化和谷胱甘肽耗竭等鐵死亡生理代謝特征。維sheng素E補救實驗可阻斷脂質過氧化造成的鐵死亡，并成功抑制LIP過表達引起的心包和卵黃囊水腫。

此外，使用檸檬酸鐵銨或去鐵胺對鐵代謝進行調節并誘導或抑制鐵死亡發生，其引發的表型特征與過表達LIP轉基因斑馬魚誘導的表型特征一致，這表明LIP蛋白通過誘導斑馬魚的鐵死亡進而調控生長發育。為進一步明確LIP與鐵死亡的相關性，研究人員對轉基因斑馬魚心臟進行電鏡觀察發現心肌細胞出現顯著的鐵死亡特征（線粒體變小，膜密度增高，嵴減少）和水腫現象，見圖1。

圖1.LIP過表達誘導斑馬魚鐵死亡導致其水腫

A：斑馬魚胚胎發育4個時期（19、36、60 和 96hpf）的鐵死亡標記分子的Western Blot檢測；B-D：斑馬魚胚胎鐵含量(B)、MDA含量(C)、T-GSH含量和GSH/GSSG比率(D)的代謝檢測；E：斑馬魚幼魚的代表性表型分為4組，P1為無水腫，P2為輕度水腫，P3為嚴重水腫，P4為極嚴重水腫；F：維sheng素E對過表達LIP斑馬魚存活率的影響；G：維sheng素E對96hpf斑馬魚拯救后的表型分級及代表性圖片；H：檸檬酸鐵銨和去鐵胺對96hpf斑馬魚鐵死亡調控后的表型分級；I：透射電子顯微鏡對斑馬魚心臟的亞顯微結構檢查顯示異常水腫和線粒體變化，粉色為細胞核，藍色為正常線粒體，紅色為鐵死亡后的線粒體。

在明確LIP誘導鐵死亡導致水腫并抑制機體發育后，研究人員探究了LIP誘導鐵死亡的調節機制，通過siRNA技術對轉錄組數據篩選到的2個重要的鐵死亡標記分子（tfr1a和acsl4a）進行RNA干擾，發現干擾acsl4a的表達降低LIP介導鐵死亡導致的水腫表型，同時干擾tfr1a和acsl4a的表達將顯著抑制LIP過表達引起斑馬魚水腫的表型，見圖2。此外，羅格列酮（acsl4a的小分子抑制劑）和二氫青gao素（tfr1a的小分子抑制劑）也可顯著抑制LIP引起的水腫表型。

圖2.LIP過表達通過tfr1a和acsl4a誘導鐵死亡的發生

A-D：siRNA技術干擾斑馬魚tfr1a基因表達的代表性表型(A)、效率(B)、存活率(C)和表型分級(D)。E-H：siRNA技術干擾斑馬魚acsl4a基因表達的代表性表型(E)、效率(F)、存活率(G)和表型分級(H)。I-L：siRNA共沉默斑馬魚tfr1a和acsl4a基因的代表性表型（I）、效率（J）、存活率（K）和表型分級（L）。

綜上所述，該研究發現了LIP蛋白可作為一種鐵死亡的誘導劑，導致組織水腫并抑制個體生長發育。該研究表明LIP是調控鐵代謝和脂質氧化的重要分子，并加深了人們對七鰓鰻的免疫分子LIP功能的認知，見圖3。

圖3.LIP介導鐵死亡的分子機制

● 討論

在過去幾年里，誘導癌細胞發生鐵死亡被認為是一種安全有效且前景廣闊的癌癥治療新策略。團隊在之前的研究中發現LIP蛋白具有選擇性識別并殺死癌細胞的能力[4]，且腫瘤細胞的死亡形態與鐵死亡相似，提示LIP可能是通過誘導鐵死亡發揮腫瘤殺傷活性。這項全新研究結果表明，七鰓鰻LIP蛋白對鐵代謝、脂代謝和生長發育具有重要的調控作用。

在漫長的進化歷程中，絕大多數與七鰓鰻同時期的物種都已滅絕，而現存的七鰓鰻作為“活化石”記載著脊椎動物起源的整個過程，從溯源研究人類和高等哺乳動物的遺傳、進化、發育及生理特征等方面，七鰓鰻有著不可替代的作用。七鰓鰻作為地球上古老和神秘的生物之一，值得更多的學者去探索其奧秘。同時也期待與國內外的同行攜手深入開展七鰓鰻的研究，更好地造福于人類的生命健康事業。

遼寧師范大學為第一作者和通訊作者單位，該研究得到國家自然科學基金、遼寧省“興遼英才計劃”科技創新人才及遼寧省教育廳重點研究等項目的資助。環特生物為本項目研究提供了定制的斑馬魚品系。

參考文獻：

[1] Du Z, Zhang D, Li J, Li Q, Pang Y. Lamprey immune protein triggers the ferroptosis pathway during zebrafish embryonic development. Cell Commun Signal. 2022;20(1):124. doi: 10.1186/s12964-022-00933-0.

[2] Pang Y, Li C, Wang S, Ba W, Yu T, Pei G, Bi D, Liang H, Pan X, Zhu T, Gou M, Han Y, Li Q. A novel protein derived from lamprey supraneural body tissue with efficient cytocidal actions against tumor cells. Cell Commun Signal. 2017;15(1):42.doi: 10.1186/s12964-017-0198-6.

[3] Ma L, Gou M, Du Z, Zhu T, Li J, Li QW, Pang Y. MicroRNA expression profile in Lampetra morii upon Vibrio anguillarum infection and miR-4561 characterization targeting lip. Commun Biol. 2021;4(1):995. doi: 10.1038/s42003-021-02525-z.

[4] Pang Y, Gou M, Yang K, Lu J, Han Y, Teng H, Li C, Wang H, Liu C, Zhang K, Yang Y, Li Q. Crystal structure of a cytocidal protein from lamprey and its mechanism of action in the selective killing of cancer cells. Cell Commun Signal. 2019;17(1):54. doi: 10.1186/s12964-019-0358-y.