背景說明

重組抗體藥物制備的下游純化工藝，主要目的是分離純化去除工藝相關雜質，如內毒素、病毒、HCP、HCD等和產品相關雜質等。

其中，HCP，即宿主細胞蛋白（Host Cell Protein）是表達重組抗體宿主細胞產生的、具有不同理化性質的復雜內源性蛋白質復合物，因其自身帶來的免疫原性和潛在的蛋白酶水解活性等，會嚴重影響抗體藥物的穩定性和功效，被認為是抗體藥物的關鍵質量屬性。HCP的去除也因此成為抗體下游工藝的關鍵目標之一。通常最終抗體藥物原液中殘留HCP的普遍接收范圍在1~100ppm。

以常見的中國倉鼠卵巢（CHO）宿主細胞生產抗體為例，在下游工藝中，主要通過親和層析、深層過濾、離子交換層析及多模式層析等純化步驟來降低HCP水平。

親和層析由于對抗體的高度結合特異性，是抗體下游純化常用的捕獲層析方法。親和層析高度選擇性的特點，是去除HCP的有效手段。

HCP和親和層析填料間的非特異性結合對HCP殘留起到的作用很小。然而，HCP與目的蛋白之間存在多位點的非特異性相互作用，會導致下游純化中兩者共純化，成為親和洗脫液中HCP存在的主要原因。

為盡量減少樣品中HCP的水平，通常在目的蛋白洗脫之前進行中間淋洗。該步驟優化的重點在于破壞HCP與親和層析介質和/或抗體之間的相互作用。通常選用介于平衡和洗脫緩沖液之間的pH范圍（如pH 5.0~6.5）進行淋洗，以去除與親和層析介質非特異性結合的HCP。但這對與目標抗體蛋白有相互作用的HCP的去除效果有限，且低pH的中間淋洗步驟有可能會影響收率，尤其在高上樣載量時。

對于此種情況，可以采用堿性淋洗緩沖液（pH 8.0~10.0）來打破抗體與HCP之間的相互作用，從而達到除去HCP的目的。

此外，在淋洗步驟過程中，除對緩沖體系及pH進行優化外，添加一定量的鹽或添加劑（例如：尿素、精氨酸、丙二醇和triton X-100等）也可顯著破壞HCP與目的蛋白之間的靜電，疏水和氫鍵相互作用。通過淋洗，可以除去柱上結合的HCP，從而顯著降低洗脫液中HCP的水平。

Table 2. 與mAb的Fab和Fc結構域被鑒定為強結合HCP的蛋白質

親和層析洗脫的樣品，在經過低pH（pH 3.5~3.8）病毒滅活后，需進行回調中和pH來與后續層析步驟進行銜接。大部分HCP（pI 4.5~7.0）在調節pH時會被跨越等電點，使溶解性降低。

對低pH病毒滅活后的回調pH值進行優化，可以選擇中和pH來選擇性的有效聚集或沉淀HCP。除此之外，也可以通過添加劑如辛酸、聚乙二醇等沉淀HCP，同時減少目標產物損失。這些經處理后的料液再通過深層過濾器對HCP的吸附特性來達到有效去除HCP的效果。

離子交換層析

親和層析和深層過濾通常可以去除90%以上的HCP，但若仍無法達到目標HCP殘留要求以下，則還需要通過精純步驟進行去除，常用方法即為離子交換層析。

由于大多數抗體與HCP相比具有較高的等電點（pI 6.5~9.0），因此可采用陰離子層析流穿模式去除HCP，即在低于抗體蛋白等電點的pH和低電導條件下進行上樣。因大部分HCP的等電點低，此上樣條件下HCP多帶負電與介質結合，而抗體蛋白帶正電不與介質結合，而是從陰離子層析柱中流穿，從而將抗體與HCP進行分離。陰離子層析可通過對上樣條件的緩沖液種類、離子強度和pH等條件進行優化。對于陰離子弱結合模式，還可以通過增加上樣量和上樣后淋洗等方式來優化提高收率。

陽離子交換層析則主要以結合洗脫模式去除產品相關的雜質。除了對緩沖液種類、離子強度和pH等條件優化，上樣條件、淋洗策略與洗脫條件優化對于去除HCP和提高產品質量也很重要。此外，陽離子交換層析也可以通過弱結合流穿模式去除HCP和聚集體。

相較其他單一模式層析，多模式層析具有更高的選擇性。抗體表面疏水和帶電荷的分布與大多數HCP表面分布不同。多模式離子層析介質利用疏水與離子協同作用，可在去除HCP等雜質上表現出較單一模式層析更優秀的性能。但也正因為多模式層析固有的復雜性（兼具多種由不同因素影響的相互作用），為了充分利用該種層析，需要進行廣泛的優化。

比如，對pH的優化，可以控制離子相互作用和結合能力，有利于提高回收率；而對電導率（上樣、淋洗及洗脫鹽濃度）的優化則決定了結合以及洗脫時的疏水相互作用。此外，添加劑如精氨酸等的使用也可以提高多模式層析的分離性和/或選擇性。

總結

實現HCP的充分去除是抗體藥物生產的一個關鍵目標，這主要取決于上游細胞培養工藝控制與下游純化工藝控制。在抗體下游純化工藝中，需要靈活應用不同方法，結合不同分離原理清除HCP。

為了去除HCP并提高工藝穩健性，對工藝中的每個步驟進行優化是至關重要的。這些不同HCP去除策略的綜合運用對保證抗體藥物的穩定性和功效至關重要。

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