在生物制藥行業抗體藥生產中，純化一直是至關重要的一環。傳統的離子交換層析純化方法主要依賴鹽梯度洗脫，但近年來，高線性pH梯度法在復雜分子（如雙特異性抗體BsAb）的純化中展現出更高的選擇性和更好的分離效果。
今天，我們將向大家介紹pH梯度法的應用，并探討其優勢與挑戰，助力大家在工藝開發中做出更合適的選擇。
pH梯度法是一種基于調節緩沖液pH的層析分離條件。通過連續變化的pH梯度，調節蛋白質的帶電荷狀態，從而影響其與離子交換層析介質的相互作用，達到分離的目的。其核心原理是：
• 不同分子在不同pH條件下電荷狀態不同
• 通過pH變化調整蛋白與填料的相互作用強度
• 可以在更精細的范圍內進行洗脫，提高分離效果
雙特異性抗體（BsAb）因其結構和治療潛力，近年在生物制藥領域備受關注。然而，由于其復雜的分子結構，雙抗的下游純化面臨更大挑戰，其雜質包括聚集體、片段和錯配分子。pH梯度法相比傳統的鹽梯度法，能夠更好地分離不同構型的蛋白，如單體、二聚體、聚集體及錯配體，特別適用于結構復雜的分子分離。
• 相比鹽梯度，pH梯度可以更精細地利用蛋白質的等電點（pI）差異，適用于復雜分子的精細分離。
• 可用于分離單體、二聚體、聚集體及錯配體，提升最終產品純度。
• 由于不依賴高鹽濃度洗脫，對某些蛋白更友好，降低聚集體的形成風險。
• 適用于對高鹽濃度敏感的分子。
• 通過緩沖液混合形成線性pH梯度，可精確控制洗脫條件。
• 可結合離子交換填料（IEX），增強對雜質的去除效果。
• pH梯度的建立需要選擇合適的緩沖體系，且需要精細調整不同pH條件，以保證蛋白穩定性。
• 不同批次樣品的pH梯度穩定性可能存在偏差，在工藝放大時需要進行額外的驗證。
• 需要高精度的梯度混合系統。
• 需要在線pH監測系統。
• 過酸或過堿的條件可能會導致蛋白變性或聚集。
• 需要額外優化pH梯度范圍，以降低蛋白損失和變性風險。
• 先嘗試較寬的pH范圍，尋找到同源二聚體、目標抗體、片段化抗體、聚體的出峰pH。
• 然后選擇低于雜質出峰0.5個pH單位作為起始點，高于目標抗體完整出峰0.5個pH單位作為終點。
• 盡量控制pH梯度范圍小于3個pH，且不跨越等電點pI，避免抗體沉淀。
選擇合適的緩沖體系：不同的梯度范圍需要不同的緩沖體系。
• 如pH4~11：15.6mM CAPS, 9.4mM CHES, 4.6mM TAPS, 9.9mM HEPPSO, 8.7mM MOPSO, 11.0mM MES 13.0mM Acetate, 9.9mM formate, 10mM NaCl, 用NaOH調節pH。
• 如pH6~8.5：A: 20mM phosphate buffer, pH6.0; B: 20mM phosphate buffer, pH8.5。
• 如pH10.5~3.5：9.8mM Methylamine、9.1mM 1,2-Ethanediamine、6.4mM 1-Methylpiperazine、13.7mM 1,4-Dimethylpiperazine、5.8mM Bis–tris、7.7mM Hydroxylamine。
在實際應用中，建議結合具體的工藝目標和蛋白分子特性選擇合適的梯度方法：
pH梯度法在去除聚集體、片段化抗體、聚體方面具有顯著優勢，適用于雙抗等復雜分子純化。但其在方法優化、設備需求和蛋白穩定性方面存在挑戰，需要根據具體情況進行權衡。建議在實際工藝開發中，通過小試篩選pH梯度范圍，結合在線監測手段，優化pH梯度條件，以獲得理想的純化效果。
你在抗體純化過程中是否遇到類似挑戰？歡迎留言交流你的經驗和看法！
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