其原理是：在PCR反應體系中加入過量熒光染料，DNA擴增的過程中，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈，發射熒光信號，隨著反應的進行，熒光強度逐漸增強，并且可以實時測量。如果你要擴增你的目標樣品40個循環，在最后一個循環結束時檢測到的熒光會比在第10個循環測得的熒光強很多。

優點：

1、成本較低，適合大規模的實驗。

2、在實驗設計階段非常省時，因為它只需要合適的引物設計。

缺點：

1、特異性不是很高。染料可以插入任何雙鏈DNA，包括引物二聚物和非特異性產物。

2、如果引物二聚體存在或者產物受到污染，得到的結果會不可靠。3、更容易與低豐度的目標產生非特異性熒光。

需要更多的時間進行結果分析。

這種方法涉及使用熒光標記的寡核苷酸(短DNA分子)，探針通常在5 '端和3 '端都被標記。

在探針的5’端有報告基團，3’端設計淬滅基團，當報告基團接近淬滅基團時，不會檢測到熒光信號。RT-qPCR反應時，寡核苷酸兩個基團分離，即可檢測到熒光信號，并與PCR產物同步。

使用這種方法的熒光檢測依賴于兩個過程:1)引物與目標序列的結合(2)探針與引物下游

互補序列的結合。

優點：

1、更有可能只放大所需的產物，由于引物和探針的結合具有特異性。

2、不需要解離曲線，只有探針與正確的目的序列結合時才能檢測到熒光。

3、由于具有特異性，數據更可靠。

4、數據分析時節省時間。

缺點：

1、需要大規模實驗時耗費成本高。

2、需要更長的時間來設計實驗，因為需要好的引物和探針。