司美格魯肽
司美格魯肽，結構見圖1[1]，是一種長效的胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)受體激動劑，但近年來，它以“減肥神藥”的姿態迅速走紅全球，成為抗肥胖治療領域的重磅藥物。其機制來自對GLP-1受體的模擬——這種腸道激素可增強胰島素分泌、抑制胃排空并作用于大腦中樞，減少饑餓感，讓人“吃得少、瘦得快”。數據顯示，2023年全球GLP-1類藥物市場規模已突破300億美元，而肥胖市場的擴張使這一數字有望在2028年飆升至700億美元。在眾多GLP-1藥物中，司美格魯肽(商品名如Ozempic用于糖尿病、Wegovy用于減肥)憑借每周僅需注射一次、降重效果顯著(平均體重可降低15%以上)，贏得了醫生和消費者的廣泛青睞。隨著市場需求井噴式增長，對司美格魯肽的高質量、大規模生產也提出了更高要求。司美格魯肽現有的合成工藝分兩類，一類是原研選擇的生物發酵結合化學合成的方法完成成品的制備；一類是多肽固相合成以及片段縮合的合成方法。多肽合成工藝過程產生的雜質如氨基酸缺失、取代或插入肽、截斷肽等，這些雜質與目標多肽的性質接近，給常規反相液相色譜的分離帶來挑戰。司美格魯肽及其相關雜質的反相液相色譜分離使用酸性磷酸氫二銨作為流動相，而磷酸氫二銨是質譜不兼容的流動相。
圖1. 司美格魯肽結構
二維液相
對復雜的多肽雜質問題，傳統的一維色譜往往力不從心。尤其是像司美格魯肽這類雜質性質相近的多肽藥物，哪怕是經驗豐富的分析專家，也常常陷入“分不清、測不準”的困境。此時，二維液相色譜(2D-LC)技術就像“顯微鏡+掃描儀”的組合，不僅看得清，還能自動分類、高效識別。二維液相（2D-LC）是一種不改變一維液相分離度和流動相組成且能在線對雜質和目標多肽進行高效鑒定的途徑。多中心切割2D-LC可以實現一針樣品在線切割多個雜質，然后通過二維泵依次沖洗到二維色譜柱中進行除鹽、洗脫和質譜鑒定，圖2為儀器流路圖。
圖2. 多中心2D-LC串聯高分辨質譜儀器流路圖(e為loop)
儀器配置
Thermo Fisher Vanquish Duo多中心二維液相色譜儀串聯高分辨質譜Orbitrap Exploris 120
泵*2：Binary Pump F(PN:VF-P10-A)
自動進樣器：Split Sampler FT(PN:VF-A10-A)
柱溫箱*2：Column Compartment H(PN:VH-C10-A)
VWD檢測器：Variable Wavelength Detector F(PN:VF-D40-A)
質譜檢測器：Orbitrap Exploris 120(PN: BRE725531)
一維色譜柱：Hypersil gold peptide 2.1*150 mm 1.9 μm
二維色譜柱：Hypersil gold C8 2.1*50 mm 1.9 μm
實驗結果：
1 一維方法重復性
本文采用Hypersil gold peptide小粒徑色譜柱和Vanquish Flex超高效液相對司美格魯肽原料藥進行純度分析，連續進樣3次，色譜結果重復性好，見圖3和表4。
圖3 司美格魯肽3針一維純度分析結果疊圖
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表4 連續進樣3次的峰（圖3“√”的3個色譜峰）保留時間和峰面積RSD
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2 多中心2D-LC-MS鑒定
面積歸一法進行峰面積計算，對于圖4中含量遠低于0.1%的峰peak1，分別進行5次在線loop富集，考察在線富集效果。peak1未在線富集進行二維除鹽后的質譜圖見圖5的A和C，C為質荷比1032處放大；peak1進行在線富集5次后進行二維除鹽后的質譜圖見圖5 的B和D，D為質荷比1032處放大，可以看出在線富集效果顯著，質譜圖的響應達到2.4E5，可以進行有效數據解析。peak1單同位素分子量4125.1021 Da, 在線富集5次后的二級碎片離子覆蓋度見圖6。
圖4中含量高于0.1%的peak2-peak11及主峰，進行直接在線除鹽和質譜鑒定。圖7和圖8展示主峰前的peak2和peak3的質譜定性結果。通過上述方法結合Thermo BioPharmaFinder5.3軟件鑒定該司美格魯肽的雜質有氧化肽、酰胺化肽、缺失肽等。
圖4 多中心2D-LC-MS鑒定的峰
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圖5 未富集的peak1的質譜圖和5次進樣在線富集到loop后的質譜圖(點擊查看大圖)
圖6 5次富集后的peak1(4125.1021 Da)的二級碎片離子覆蓋度(點擊查看大圖)
圖7 peak2(分子量為單同位素峰為3472.7290 Da的缺失肽雜質)的二級碎片離子覆蓋度(點擊查看大圖)
圖8 peak3(分子量為單同位素峰為4127.1172 Da的氧化肽雜質)的二級碎片離子覆蓋度(點擊查看大圖)
結論：
1、利用Hypersil gold peptide專用色譜柱和超高效液相色譜Vanquish Flex能對該司美格魯肽原料藥的純度進行較好的分離，且重復性好。
2、多中心2D-LC-MS對含量非常低的peak1進行在線富集再除鹽進質譜響應，比未富集的peak1的質譜響應明顯提高。未富集的peak1的質譜數據質量沒法進行解析。通過此在線富集方式，可以提高至少5倍的檢測靈敏度，該方法對于低含量的物質的鑒定，具有很好的借鑒價值。
3、本方法對于含量不低于0.1%的雜質和主峰進行至少一次實驗可以切割5個餾分，然后依次在線除鹽進質譜鑒定，鑒定出該司美格魯肽具有雜質：W25氧化肽、E21酰胺化肽、缺失肽等。多中心2D-LC方法相比較傳統的單中心2D-LC方法效率提高5倍。
4、借助變色龍軟件eWorkflow的優勢，該方法可以便捷地轉移到各種多肽類藥物、小分子藥物、生物藥等2D-LC-MS的雜質鑒定。
參考文獻：
[1]Sanjay Kalra,Rakesh Sahay.A review on semaglutide:an oral glucagon-like peptide 1 receptor agonist in management of type2 diabetes mellitus[J].2020.06.
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