自1982年第一款重組蛋白藥物進入市場(第一款人胰島素1實現商業化)以來，生物制藥領域見證了蛋白質治療藥物數量的持續擴大。例如，單克隆抗體(mAb)、生長因子、激素是目前用于治療癌癥、HIV、多發性硬化癥等多種疾病的生物治療藥物2。這些生物治療藥物的復雜生產工藝涉及精確的蛋白質定量，以確保最終配方的療效和質量。此外，蛋白質還是研究酶活性、基因表達調控、信號通路和疾病機理的各種生物分子檢測的關鍵成分。所有執行這些檢測的實驗室均會進行蛋白質定量分析，以揭示復雜的生物分子機制。
根據所需的精度、動態定量范圍、與潛在污染物(洗滌劑、還原劑和溶劑)的相容性以及蛋白質間的差異，目前有多種方法可用于蛋白質定量。這些方法包括直接蛋白質紫外吸收測量法(A280)、銅基測定法(BCA和Lowry方法)、蛋白質-染料復合物吸收(Bradford)、熒光基測定和更復雜的測定，如ELISA或Western-Blot測定。
在本研究中，選擇熒光法是基于其優異的靈敏度、特異性以及特別適合于復雜生物樣品中低豐度蛋白質的檢測。使用珀金埃爾默FL 6500™熒光光譜儀監測NanoOrange®熒光團與BSA非共價相互作用時觀察到的熒光增強，并構建了標準曲線。
01
實驗
NanoOrange®蛋白質定量試劑盒購自賽默飛世爾科技公司，包含以下試劑:
• 緩沖液(10X)50 ml
• 500 μL BSA(牛血清白蛋白-2mg/mL)水溶液
• NanoOrange(500x)1 mL
用milliQ水將緩沖液按1:10的比例稀釋，然后加入NanoOrange原液(500X)中，制備NanoOrange工作溶液(1X)。使用NanoOrange工作溶液(1X)稀釋BSA蛋白原液(2 mg/mL)，以制備濃度范圍為0~8μg/mL的標準樣品，用于構建校準曲線。將BSA與NanoOrange熒光團混合后，在90°C下孵育10分鐘以使蛋白質變性，然后按照試劑盒手冊的說明冷卻20分鐘。
在整個樣品制備過程中，溶液始終處于避光狀態，以避免光漂白。由于FL 6500熒光光譜儀采用先進的光學設計和激發光束高度較低，僅需將1 mL工作溶液轉移到1 cm石英比色皿中，并置于單樣品池支架中。使用表1中報告的參數，應用FL Spectrum軟件中的定量模式(使用λem = 600 nm處的強度進行掃描)采集熒光。對于每個BSA-NanoOrange標準溶液，熒光強度采集三次，每次采集前搖晃溶液，然后用空白(緩沖液X1)減去熒光強度，以創建標準曲線。使用三天內制備的三個獨立的工作溶液系列重復檢測，以驗證基于熒光的檢測方法。
表1. 利用FL 6500熒光參數采集BSA-NanoOrange發射和激發光譜。
02
結果
NanoOrange是一種在水溶液中熒光較弱的份菁染料，但在與蛋白質表面相互作用后，其熒光能力增強，因此適合用于基于熒光的蛋白質定量檢測。首先，研究了NanoOrange在有或無4 μg/mL BSA溶液情況下的光譜行為。如圖1所示，與BSA結合后，發射光譜(λexc = 470 nm)和激發光譜(λem = 600 nm)均顯著增強。在λem = 600 nm附近觀察到最大發射波長，并利用此波長采集熒光強度以創建標準曲線。
圖1.NanoOrange與BSA(4 μg/mL)絡合后熒光增強。在λexc = 470 nm處采集游離NanoOrange(藍線)和NanoOrange+BSA(粉紅線)的發射光譜。在λem = 600 nm處采集游離NanoOrange(橙線)和NanoOrange+BSA(綠線)的激發光譜。使用FL Spectrum軟件的數據分析工具顯示光譜。(點擊查看大圖)
根據試劑盒手冊的說明，在構建標準曲線之前，必須加熱NanoOrange-BSA復合物溶液以促進蛋白質變性并促進NanoOrange結合。通過采集NanoOrange-BSA復合物(BSA 8 μg/mL)在90°C下孵育10分鐘、冷卻20分鐘前后的發射(λexc = 470 nm)和激發光譜(λem = 600 nm)研究加熱對熒光強度的影響。圖2報告了結果，證實了兩個光譜的熒光增強。
圖2.加熱對NanoOrange+BSA溶液(8 μg/mL)的激發和發射光譜的影響。在λem = 600 nm處采集激發光譜，而在λexc = 470 nm處采集發射光譜。使用FL Spectrum軟件的數據分析工具顯示光譜。(點擊查看大圖)
在濃度0~8 μg/mL范圍內建立標準曲線。在整個檢測范圍內，熒光強度與BSA濃度的關系圖可以用四階多項式函數3,4擬合，相關系數R2 = 0.999(圖3)。在較低濃度范圍內(≤1 μg/mL)，熒光強度響應與BSA濃度呈線性關系，并且該圖可采用線性回歸模型進行擬合，相關系數R2 = 0.994(見圖4)。所有三個獨立的標準溶液系列的線性(0.995和0.997)和四階(0.991和0.998)多項式函數擬合的相關系數均高于0.99。
圖3.采用四階多項式函數擬合整個檢測BSA濃度0-8 μg/mL范圍內的標準濃度曲線。(點擊查看大圖)
圖4.BSA濃度較低范圍(0 ~ 1μg/mL)內的標準濃度曲線。熒光強度可以用線性回歸函數來擬合。(點擊查看大圖)
結論 summary
經證明，NanoOrange™熒光法是一種簡單且靈敏的蛋白質定量方法。FL 6500熒光光譜儀可用于監測染料與BSA偶聯后的熒光增強，并可建立標準曲線。FL 6500的先進光學設計及其激發源的低光束高度允許在標準1 cm熒光比色皿中使用1 mL較小體積的溶液(標準比色皿通常使用2 mL)。
考慮到熒光法提供的高靈敏度，這比傳統的比色法具有更大的優勢，可以降低樣品用量并擴大動態范圍。運行FL 6500的FL Spectrum軟件的增強安全版本完全符合21 CFR第11部分的要求，為所有需要在受監管環境中進行蛋白質定量的實驗室提供了有效的解決方案。
所用耗材
參考文獻
1.Clark, A. L., et al.(1982).Biosynthetic human insulin in the treatment of diabetes:a double-blind crossover trial in established diabetic patients.The Lancet,320(8294),354-357.
2.Leader, B., et al.(2008).Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nature reviews Drug discovery, 7(1),21-39.
3.Harvey, M. D., et al.(2001).Utilization of the non-covalent fluorescent dye,NanoOrange,as a potential clinical diagnostic tool:Nanomolar human serum albumin quantitation.Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications, 754(2),345-356.
4.Jones, L. J., et al.(2003).Development and characterization of the NanoOrange® protein quantitation assay:a fluorescence-based assay of proteins in solution. Biotechniques, 34(4),850-861.
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