北京時間10月2日，備受矚目的“2023年諾貝爾生理學或醫學獎”被授予科學家Drew Weissman和Katalin Karikó，以表彰他們在mRNA疫苗領域的杰出貢獻。
 

　　在新冠爆發之前，mRNA疫苗對大多數人來說還是一個相對陌生的概念。這種疫苗是通過編碼病原體某個蛋白組分的基因序列的mRNA，在體內表達成蛋白質進行抗原呈遞，并具有自佐劑作用。相比其他疫苗，mRNA疫苗具有“即插即用”的優勢，只需知道病原體結構蛋白的基因序列就可以進行大規模生產。此外，它還能在體內引發強烈的免疫應答，并產生高滴度的抗體，因此被選為疫苗之選。接下來，讓我們一起看看兩位諾獎得主在2018年發表的一篇文章^[1]，以更好的理解mRNA疫苗到底有多牛！
 

 

　　這篇文章對mRNA疫苗的研究非常全面:
 

　　1、涉及了流感疫苗、HIV疫苗和寨卡疫苗
 

　　2、包含小鼠和靈長類動物實驗
 

　　3、從體液應答和細胞免疫應答等方面對疫苗進行評估
 

　　m1Ψ-mRNA-LNP 可長時間有效地生產蛋白質
 

　　1-甲基假尿苷(m1Ψ)修飾mRNA，可以防止mRNA疫苗在體內產生炎癥反應，同時還能提高蛋白質的表達效率。這是兩位諾貝爾獎獲得者對mRNA疫苗做出的重要改進之一。接下來，我們來看一下這種改進帶來的實驗結果：
 

　　圖1. 相對與未修飾的mRNA-LNP，編碼熒光素酶(Luc)的m1Ψ-mRNA-LNP的翻譯水平較高，并可以維持13天的蛋白質表達
 

　　小鼠細胞免疫評估
 

　　圖2. 相比于對照mRNA、滅活流感病毒疫苗以及未修飾mRNA疫苗，m1Ψ修飾的HA mRNA疫苗(編碼流感病毒HA蛋白)能產生更強的抗原特異性CD4+細胞免疫應答
 

　　對于CD8+細胞免疫應答結果也類似。HA mRNA疫苗免疫后，總脾GC(生發中心)B細胞大幅增加(約8-59倍)，單次免疫后8天脾漿細胞的數量也增加，并顯著增加了脾臟中Tfh細胞(濾泡輔助性T細胞)總數
 

　　小鼠抗體評估
 

　　流感疫苗誘導的抗體滴度主要通過血凝抑制(HAI)測定法來測量。在這種方法種，1:40的體外HAI滴度被認為可以保護人類免受流感感染。在接種HA mRNA疫苗單次免疫后，在2周觀察到640的HAI滴度，在4周時這個數值增加到2000。
 

　　圖3. 在體液免疫應答方面，mRNA疫苗所產生的抗體滴度是最高的，并且能持續至少一年不降低
 

　　在靈長類動物實驗中，編碼寨卡病毒prM-E蛋白的mRNA疫苗，也產生了持續一年的高滴度抗體。
 

　　抗體親和力測定
 

　　由于Tfh細胞促進親和力成熟，小鼠單次免疫HA mRNA疫苗后多克隆抗體的親和力是重要表征模型。而高滴度不一定意味著高親和力，所以在這篇文章中，作者使用賽多利斯Octet® 非標記分子互作系統來檢測血清中多克隆抗體的親和力！首先使用AMC傳感器(anti-mouse IgG)固化血清中的抗體，與31.25nM的HA進行結合解離，并用pH2.5的甘氨酸進行再生，然后用1:1模型擬合獲得KD值(平衡解離常數)。
 

　　在接種疫苗2周后，產生的抗體親和力隨著接種時間增加而增加，4周的時候KD值為362pM,8周的時候為6pM。相比之下，使用未修飾的mRNA或滅活的流感病毒顆粒免疫的小鼠中抗體的親和力低得多。Tfh細胞反應通過體細胞超突變驅動親和力成熟；但是需要進一步對Ig可變基因進行測序，并檢測純化的單克隆抗體的親和力。
 

　　圖4. Octet® 測試結果發現：mRNA疫苗免疫時間越長，抗體親和力越高；縱坐標為KD值(單位nM)
 

　　圖5. 相對于未修飾的mRNA疫苗(中)和滅活疫苗(右)，修飾的mRNA疫苗(左)的親和力最高
 

　　高親和力抗體的產生是中和多種病原體的基礎。這項研究證明了m1Ψ-mRNA-LNP疫苗能夠產生針對流感病毒、ZIKV和HIV-1的高滴度、高親和力和持續性中和抗體的能力。
 

　　輝瑞和BioNtech的 mRNA疫苗（BNT162b2）
 

　　卡里科博士作為BioNTech公司的高級副總裁，在新冠爆發后，帶動了新冠mRNA疫苗的問世。
 

　　它是頭一個大規模使用的新冠mRNA疫苗。在其遞交給歐洲藥物管理局(EMA)的評估報告^[2]和發表的Nature研究性文章^[3]中均提到：
 

　　利用Octet® 非標記分子互作系統(BLI技術)來測定mRNA表達產物的結合活性。通過生物傳感器分別固化ACE2和抗體，與293T細胞中表達的不同濃度的S蛋白(疫苗表達產物)進行親和力測定。兩者的親和力均在nM級別，符合正常S蛋白與受體及中和抗體的結合能力，并以此作為疫苗功能確認的指標之一。
 

　　在其公布臨床前研究中可發現，該疫苗編碼的是S蛋白，其中986/987位氨基酸殘基突變成了脯氨酸，與野生型S蛋白相比，不會與細胞膜融合，維持了融合前構象。該疫苗的表達產物保持了與受體ACE2以及一種RBD中和抗體的親和力。同時，還同時設計了其他序列，一起與BNT162b2平行比較，最終選擇了BNT162b2作為候選mRNA疫苗。
 

　　我們都知道，從分子生物學的角度來看，RNA是一種非常不穩定的分子。然而，通過幾十年的技術積累，科學家們成功的將RNA做成一類疫苗，并在新冠疫情種拯救了數以千萬計的生命。這也就是為什么這次諾貝爾醫學獎眾望所歸的原因吧。
 

 

　　使用Octet® 非標記分子互作系統的優勢？
 

　　· 非標記Direct Binding是趨勢，它的親和力測試結果更準確

　　· 快速測定親和力，更加定量化對互作進行表征

　　· 無洗滌步驟，可測弱親和力(解離快) 

　　· 測試時間短，一般10-20分鐘，更快拿到結果 

　　· 實驗形式多樣化：定性，兩者結合，協同/競爭實驗，垂釣 

　　· 寫入了美國藥典，文章多于13,000篇，認可度廣 

　　· 萬金油技術，可以用于檢測DNA、小分子、蛋白等各種生物分子 

　　· 使用方便，成本相對低，對粗樣品耐受性好；比如本文就直接檢測小鼠血清抗體

　　· 通量大；本文就用Octet® 檢測了十幾個小鼠樣本(多濃度)

       -參考文獻-

         [1] Nucleoside-modified mRNA vaccines induce potent Tfollicular helper and germinal center B cell responses. J. Exp. Med. 2018 Vol. 215 No. 6 1571–1588
         [2] Procedure No. EMEA/H/C/005735/0000.
         [3] Vogel AB, Kanevsky I, Che Y, Swanson KA, Muik A, Vormehr M, Kranz LM, Walzer KC, Hein S, Güler A, Loschko J, Maddur MS, Ota-Setlik A, Tompkins K, Cole J, Lui BG, Ziegenhals T, Plaschke A, Eisel D, Dany SC, Fesser S, Erbar S, Bates F, Schneider D, Jesionek B, Sänger B, Wallisch AK, Feuchter Y, Junginger H, Krumm SA, Heinen AP, Adams-Quack P, Schlereth J, Schille S, Kröner C, de la Caridad Güimil Garcia R, Hiller T, Fischer L, Sellers RS, Choudhary S, Gonzalez O, Vascotto F, Gutman MR, Fontenot JA, Hall-Ursone S, Brasky K, Griffor MC, Han S, Su AAH, Lees JA, Nedoma NL, Mashalidis EH, Sahasrabudhe PV, Tan CY, Pavliakova D, Singh G, Fontes-Garfias C, Pride M, Scully IL, Ciolino T, Obregon J, Gazi M, Carrion R Jr, Alfson KJ, Kalina WV, Kaushal D, Shi PY, Klamp T, Rosenbaum C, Kuhn AN, Türeci Ö, Dormitzer PR, Jansen KU, Sahin U. BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2. Nature. 2021 Apr;592(7853):283-289. doi: 10.1038/s41586-021-03275-y. Epub 2021 Feb 1. PMID: 33524990.